亲水性液相色谱串联质谱法测定红甜菜中甜菜碱含量的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种红甜菜中甜菜碱含量的检测方法，其通过采用亲水性液相色谱串联质谱法测定，该方法包括：配置已知浓度的甜菜碱标准品储备液；将标准储备液用超纯水稀释成不同浓度的标准溶液系列，而后分别注入到液相色谱‑串联质谱中进行检测得到标准曲线或回归方程；称取糊状的甜菜糊样品，加入硅藻土，萃取后处理得到提取液，并过0.22μm滤膜等处理后得到检测液；最后通过UPLC‑MS/MS检测并结合标准曲线或回归方程得到甜菜碱含量。本发明专利技术的检测方式采用改进的方法结合亲水性液相色谱串联质谱技术，建立了红甜菜中甜菜碱的定量分析方法，其与传统的分析方法相比，具有检出限低、灵敏度高的优点，完全可以适用于甜菜中甜菜碱的分析检测。

【技术实现步骤摘要】
亲水性液相色谱串联质谱法测定红甜菜中甜菜碱含量的检测方法
本专利技术属于检测
，具体涉及一种亲水性液相色谱串联质谱法测定红甜菜中甜菜碱含量的检测方法。
技术介绍
红甜菜又叫火焰菜、紫菜头、根甜菜、血头，是栽培甜菜的一个变种，属黎科甜菜属。原产于北非、欧洲和西亚地中海一带，是欧美各国的重要蔬菜之一。长久以来，红甜菜在欧洲民间一直保持着极高的地位，就好比中国的灵芝。我国现有少量栽培，主要以球形肉质根供食用。其有钾、钙、镁、铁元素以及15种氨基酸，其中人体需要的氨基酸有8种。红甜菜色泽鲜艳，富含天然红色素及多种维生素，另外，甜菜碱的含量较高。这种具有抗氧化功能的生物碱，存在于多种植物的根、茎、叶及果实中，是一种天然营养物质，易溶于水和甲醇，属于季铵型水溶性生物碱，能够提供甲基，参与脂肪代谢，具有降血脂、防治脂肪肝和降压作用。另外研究表明，甜菜碱具有解热及抗肿瘤作用，因此，甜菜碱的应用较为广泛，是良好的饲料及食品添加剂，还可以作为多功能表面活性剂，用在护发及护肤品上，例如洗发香波、洗手液等等。甜菜碱又称三甲胺乙内酯、甜菜素、三甲铵乙内盐，为甘氨酸的季铵衍生物，是氨基酸氨基上的氢被甲基取代后形成的一类氮甲基化合物或三甲基内盐，属季铵型生物碱。在色谱分析中，属于极性比较大物质。目前，甜菜碱的测定方法主要有：酸碱滴定法、凯氏定氮法、紫外分光光度法、高氯酸非水滴定法、薄层色谱法、离子色谱法、高效液相色谱法等。各种方法各有优缺点，其中薄层扫描法适用于枸杞中甜菜碱含量测定，由2015版《中国药典》(一部)中规定的。甜菜碱含量占枸杞干重的3％以上，可以使用此方法。但是此方法操作较为繁琐，重现性差，MostafaluR等采用离子色谱-电导检测器测定了枸杞中的甜菜碱，取得了比较好的效果。龚立冬等用光谱法测定植物组织中的甜菜碱含量，刘英华等用毛细管电泳法测定小麦叶片中甘氨酸甜菜碱的含量。还有一种常用的方法是高效液相色谱法，采用蒸发光散射检测器，其重复性及线性良好。对于甜菜中的甜菜碱，最常用的方法是雷氏盐分光光度法，测定之前需要先把甜菜鲜样烘干，甜菜碱与雷氏盐反应生成沉淀，丙酮溶解，从而测定吸光度，过程比较复杂，而且检出限较高，灵敏度低。尽管以上方法各有优点，但也存在一些问题，如光谱法和毛细管电泳法准确度不高，正向高效液相色谱法和离子色谱法前处理复杂，干扰物质较多。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检出限低、灵敏度高，适用于甜菜中甜菜碱含量的检测分析的，亲水性液相色谱串联质谱法测定红甜菜中甜菜碱含量的检测方法。为了达到上述目的，本专利技术所采用的方案是：一种红甜菜中甜菜碱含量的检测方法，其通过采用亲水性液相色谱串联质谱法测定，以降低检出限、提高灵敏度，其尤其适用于甜菜中甜菜碱的分析；该方法具体包括以下步骤：S1标准溶液配置：准确称取甜菜碱标准品，用超纯水溶解，定容后配置成已知浓度的标准储备液(较佳为200mg/L)，使用时用超纯水进行稀释，从而配置成不同浓度的标准溶液系列(即一系列具有不同已知浓度的标准品溶液)。S2标准曲线测定：将上一步骤获得的不同浓度的标准品溶液分别注入到液相色谱-串联质谱中进行检测并以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，或进一步得到回归方程。S3样品前处理：其包括提取的步骤、净化的步骤和检测液制备的步骤；提取的步骤包括：使用快速溶剂萃取仪进行萃取，将甜菜样品事先用锯糊机制成糊状，然后称取一定质量的甜菜糊样品，加入硅藻土(较佳加入量为甜菜糊样品2-6倍质量)，研磨均匀，装入萃取池中并加入萃取溶剂进行萃取；萃取后得到的萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩至干，用甲醇溶解后，再用甲醇多次冲洗旋蒸烧瓶，然后转移至容量瓶中并定容至刻度得到提取液；检测液制备的步骤包括：准确移取提取液于玻璃离心管中，经氮吹仪吹干后，再用甲醇溶解并定容，过0.22μm滤膜后，作为检测液供液相色谱－质谱/质谱仪测定使用；S4样品测定：通过液相色谱－质谱/质谱仪，对上述的检测液进行检测，并结合步骤2得到的标准标准曲线或回归方程，获得检测液中的甜菜碱含量；更佳地，所述步骤2和步骤4中的色谱和质谱的检测条件是完全相同的。优选地，所述色谱条件为：色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHHILIC：50mm×2.1mm(i.d)，粒度1.7μm，柱温40℃，流动相：A相为乙腈，B相为5mM乙酸铵溶液，进样量5uL，梯度洗脱。更佳地，所述色谱条件中的流动相及梯度洗脱的条件为：进一步地，所述质谱条件：ESI源，MRM(多反应监测)，采用电喷雾正离子模式电离，电压在2kv～3kv之间，离子对m/z分别为118.1/58和118.1/59.1，去溶剂气和锥孔气均为高纯氮气，流速分别为650L/h和50L/h；碰撞气(其优选为高纯氩气)流速0.14mL/min。其它条件如下表所示。优选地，稀释后的标准溶液系列的浓度分别为0.05ug/mL、0.1ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL、5ug/mL。优选地，所述样品前处理的步骤中还包括净化的步骤，其位于提取的步骤和检测液制备的步骤之间，所述净化的步骤包括：吸取上述适量提取液于螺旋盖聚丙烯离心管中，加入无水硫酸镁、PSA和C18，在旋涡混合器上混合后离心，得到净化液。后续检测液制备的步骤中使用所述净化液进行制备操作。较佳地，吸取上述提取液5mL于15mL螺旋盖聚丙烯离心管中，加入900mg无水硫酸镁、100mgPSA和100mgC18，在旋涡混合器上混合2min，5000r/min离心5min，得到净化液。后续检测液制备的步骤中使用所述净化液进行制备操作。优选地，所述萃取溶剂选用甲醇。进一步地，所述萃取条件为：萃取温度100℃，加热时间5分钟，静态萃取时间5分钟，萃取压力1500psi，循环三次，氮气吹扫时间60秒，冲洗体积60vol％。本专利技术的检测方法使用亲水性液相色谱-串联质谱技术结合快速溶剂萃取仪测定了红甜菜中甜菜碱含量。此方法前处理步骤简单、快速，回收率及精密度均满足要求，具有快速，准确、灵敏的优点，可用于甜菜中甜菜碱含量的测定。其采用特别的样品前处理方法结合亲水性液相色谱串联质谱技术，建立了红甜菜中甜菜碱的定量分析方法，样品经快速溶剂萃取仪以甲醇为溶剂提取，经固相萃取柱净化，采用正向亲水性液相色谱柱(Hilic)，梯度洗脱，通过质谱的多反应监测(multiplereactionsmonitoring，MRM)正离子模式扫描进行测定，外标法定量。结果表明：甜菜碱在本方法的线性范围为0.05ug/mL～5ug/mL，甜菜碱标准品添加水平为4mg/g～16mg/g时，回收率为87.7％～95.7％，方法RSD值为3.69％～8.4％，检出限为0.01mg/L，定量限为0.04mg/L，与传统的分析方法相比，具有检出限低、灵敏度高的优点，完全可以适用于甜菜中甜菜碱的分析。因此，本专利技术亲水性液相色谱-串联质谱法，可以最大限度的排除基质的干扰，该方法具有快速、灵敏度高的优点，为甜菜中甜菜碱的测定提供可靠的检验方法。附图说明图1是甜菜碱的标准品谱图；图2是甜菜碱的空白谱图，采用8.8mg/g的甜菜碱样品检测得到；图3是甜菜碱的回收谱图，其是在标准品添加量为4.0mg/g的水平下测得的，甜菜碱的回收本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.亲水性液相色谱串联质谱法测定红甜菜中甜菜碱含量的检测方法，该方法包括以下步骤：S1标准溶液配置：准确称取甜菜碱标准品，用超纯水溶解，定容后配置成已知浓度的标准储备液，使用时用超纯水进行稀释，从而配置成不同浓度的标准品溶液系列；S2标准曲线测定：将步骤S1的标准品溶液分别注入到液相色谱－质谱/质谱仪中进行检测并以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，或得到回归方程；S3样品前处理：其包括提取的步骤、净化的步骤和检测液制备的步骤；提取的步骤包括：使用快速溶剂萃取仪进行萃取，将甜菜样品用锯糊机制成糊状后称取甜菜糊样品，加入硅藻土，研磨均匀，装入萃取池中并加入萃取溶剂进行萃取；萃取后得到的萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩至干，用甲醇溶解后，再用甲醇多次冲洗旋蒸烧瓶，然后转移至容量瓶中并定容至刻度得到提取液；检测液制备的步骤包括：准确移取提取液于玻璃离心管中，经氮吹仪吹干后，再用甲醇溶解并定容，过0.22μm滤膜后，作为检测液供液相色谱－质谱/质谱仪测定使用；S4样品测定：通过液相色谱－质谱/质谱仪，对上述的检测液进行检测，并结合步骤2得到的标准标准曲线或回归方程，获得检测液中的甜菜碱含量。

【技术特征摘要】
1.亲水性液相色谱串联质谱法测定红甜菜中甜菜碱含量的检测方法，该方法包括以下步骤：S1标准溶液配置：准确称取甜菜碱标准品，用超纯水溶解，定容后配置成已知浓度的标准储备液，使用时用超纯水进行稀释，从而配置成不同浓度的标准品溶液系列；S2标准曲线测定：将步骤S1的标准品溶液分别注入到液相色谱－质谱/质谱仪中进行检测并以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，或得到回归方程；S3样品前处理：其包括提取的步骤、净化的步骤和检测液制备的步骤；提取的步骤包括：使用快速溶剂萃取仪进行萃取，将甜菜样品用锯糊机制成糊状后称取甜菜糊样品，加入硅藻土，研磨均匀，装入萃取池中并加入萃取溶剂进行萃取；萃取后得到的萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩至干，用甲醇溶解后，再用甲醇多次冲洗旋蒸烧瓶，然后转移至容量瓶中并定容至刻度得到提取液；检测液制备的步骤包括：准确移取提取液于玻璃离心管中，经氮吹仪吹干后，再用甲醇溶解并定容，过0.22μm滤膜后，作为检测液供液相色谱－质谱/质谱仪测定使用；S4样品测定：通过液相色谱－质谱/质谱仪，对上述的检测液进行检测，并结合步骤2得到的标准标准曲线或回归方程，获得检测液中的甜菜碱含量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件为：色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHHILIC：50mm×2.1mm(i.d)，粒度1.7μm，柱温40℃，流动相：A相为乙腈，B相...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴玉梅，周芹，刘乃新，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23