通过HPLC-MS-MS法同时测定不同品种桂花中7种多酚类活性成分的含量的方法技术

本发明专利技术提供了一种一种通过HPLC‑MS‑MS法同时测定不同品种桂花中7种多酚类活性成分的含量的方法，属于生化技术领域。用色谱柱Shim‑pack VP‑ODS(2.0×150mm,5μm)，以甲醇‑0.1％甲酸水为流动相，梯度洗脱，体积流量为0.2mL·min‑1，柱温30℃，进样量5μL；质谱采用ESI离子源，多反应监测的负离子扫描方式进行检测，结果7种成分在测定浓度范围内均具有良好的线性关系。精密度、重复性和稳定性良好；并符合方法学考察要求。所建立的方法简便，快速，灵敏，专属性强，可用于桂花中绿原酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、芦丁、阿魏酸和槲皮素7种多酚类活性成分的同时测定。

【技术实现步骤摘要】
通过HPLC-MS-MS法同时测定不同品种桂花中7种多酚类活性成分的含量的方法
本专利技术属于生化
，涉及一种通过HPLC-MS-MS法同时测定不同品种桂花中7种多酚类活性成分的含量的方法。
技术介绍
酚类化合物是起源于植物中的一类主要次生代谢产物，是天然的植物化学物质。主要来自苯丙氨酸，较少来自酪氨酸，广泛存在于食品和营养品中。酚类化合物结构多样，但可以定义为具有至少一个带有一个或多个芳环羟基物质。根据羟基化芳香族的数量环和功能部分的类型，主要的多酚类有：黄酮类，酚酸类，酚醇类，二苯乙烯类和木脂素类。多酚是人类饮食的重要组成部分，广泛存在于浆果，葡萄/葡萄酒，茶，巧克力/可可，咖啡，大豆和其他水果和蔬菜中。起初，酚类化合物因其强大的抗氧化活性而备受关注。不久之后，在天然食物中发现的酚类对氧化损伤导致的疾病具有潜在的保护作用(例如冠心病，中风和癌症)。最近，越来越多的科学文献表明酚类化合物对癌症具有有效的抑制入侵和转移作用。由于多酚的生理活性与他们的结构相关，详细了解多酚非常重要，重要的是量化植物提取物中的多酚含量，以评估它们对药理活性的影响。桂花(OsmanthusfragransLour.)为木犀科(Oleaceae)木犀属(Osmanthus)植物，产于中国西南部等地，是我国十大传统名花之一。《本草纲目》中记载:桂花籽，味甘辛，性温，能暖胃、益胃、驱寒。亦有研究报道，桂花具有疏肝理气、祛痰止咳和顺肺开胃的功效。文献研究表明，桂花含酚类、环烯醚萜类、三萜、木脂素类、苯丙素类、苯乙醇类、生物碱类等多种化学成分，因此它具有良好的药用价值。薛阿辉等采用HPLC法从四季桂花醇提液中检测到15种多酚类化合物，利用电喷雾萃取电离质谱分析检测到8种多酚化合物。研究桂花中的酚类化合物，开发新的天然抗氧化剂，对人类健康有极大的益处。以往的研究多局限在桂花提取分离工艺、性质研究及药理活性方面的研究。并未系统比较桂花中单个多酚类活性成分含量的差异以及在不同品种桂花中的分布情况。目前，对桂花成分的含量测定主要是紫外分光光度法和高效液相色谱法，还未见用液质联用技术分析桂花中多酚类活性成分的国内外文献报道。高效液相色谱串联质谱法通常用于酚类化合物结构特征鉴定。与HPLC-DAD方法相比，HPLC-MS-MS方法具有更高灵敏度、选择性和更高通量定量的优点。本研究采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS-MS)技术对三个不同桂花品种(丹桂、金桂、银桂)中7种多酚类活性成分的进行结构鉴定，结合标准品质谱对比，确定了桂花中多酚类活性成分的化合组成及含量，为进一步研究桂花的开发和利用提供科学依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有的技术存在的上述问题，提供一种通过HPLC-MS-MS法同时测定不同品种桂花中7种多酚类活性成分的含量的方法，本专利技术所要解决的技术问题是如何简便、快速、灵敏的测定不同桂花中多酚类活性成分的含量。本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现：一种通过HPLC-MS-MS法同时测定不同品种桂花中7种多酚类活性成分的含量的方法，其特征在于，本方法包括如下步骤：1)、制备供试品溶液：称取2.5g桂花粉末，加入80％乙醇溶液50mL，称重后，超声提取30min，自然放冷，称重，用浓度为80％的乙醇溶液补足失重，摇匀，过滤；吸取1mL提取液稀释5倍，使用0.22μm的微孔滤膜过滤，得到桂花供试品溶液，平行制得各组待测样品溶液5份，供HPLC-MS-MS分析用；2)、配制标准品溶液：用电子天平分别称取各标准品0.005g，分别用5mL甲醇完全溶解后得到质量浓度为1mg·mL-1的单一标准品储备液；3)、设置HPLC-MS-MS分析条件：其中，色谱柱条件为：色谱柱型号为Shim-packVP-ODS2.0×150mm，柱温为30℃，流动相为甲醇-0.1％甲酸，梯度洗脱的流速0.2mL/min，进样量为5μL；质谱条件为：电喷雾负离子模式，电喷雾电压为3.5kV，雾化气体为N2，雾化气流速为3L/min；离子源温度为250℃；碰撞气体为高纯氮气；碰撞气压力为230kPa；采用多反应检测扫描方式；4)、本测定方法中的方法学考察：精密度的考察：准确吸取混合对照品溶液，在同一天内重复进样6次，计算日内精密度RSD；稳定性的考察：取混合对照品溶液，室温放置，在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h进样分析，测定峰面积并计算RSD；重复性的考察：取丹桂样品6份，制作6组平行样品，进行平行实验测定并计算RSD值；加标回收率的考察：精密称取已测知7种物质含量的丹桂提取物共6份，分别加入适量混合标准品溶液，按步骤1)的方法准备样品进行分析，分别计算7种成分的平均回收率和RSD；线性关系的考察：取按照步骤2)的方法制备的对照品储备液适量，混合，再用甲醇水溶液稀释配制6个系列梯度浓度的混合对照品溶液；用步骤3)的HPLC-MS-MS方法进行检测；峰面积比值为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)，进行回归，以获得各成分在各自范围内的线性关系；样品中待测成分的含有量的测定：取3个品种的桂花按步骤1)的方法制备的供试品溶液，在步骤3)的色谱条件下测定。在上述的一种通过HPLC-MS-MS法同时测定不同品种桂花中7种多酚类活性成分的含量的方法中，样品桂花的粉末是通过在60℃干燥至恒重，再经粉碎过0.25mm筛获得的干燥花瓣的粉末。在上述的一种通过HPLC-MS-MS法同时测定不同品种桂花中7种多酚类活性成分的含量的方法中，其中甲醇为Sigema公司生产的色谱纯试剂；甲酸采购于韩国德山药业工业；纯净水为杭州娃哈哈集团有限公司生产的纯净水；对照品的纯度≥98％，且其中的绿原酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、芦丁、阿魏酸、槲皮素均购自上海源叶生物科技有限公司。在上述的一种通过HPLC-MS-MS法同时测定不同品种桂花中7种多酚类活性成分的含量的方法中，本方法所用仪器为：日本岛津LCMS-8040液相色谱－三重四极杆质谱联用仪，配有ESI离子源、二元梯度泵LC-20ADXR型、自动进样器SIL-20ACXR型、柱温箱CTO-20AC型和系统控制器CBM-20A型；电子天平为FA2004续滤液型；超声波清洗机为PL-S100型；干燥箱为PCE-3000型。所建立的HPLC-MS-MS方法可以鉴定和定量三个桂花品种中存在的7种主要多酚，可以作为的重要分析工具，特别适用于食品、化妆品和药品的质量控制。首次用HPLC-MS-MS方法研究三个桂花品种中7个黄酮和酚酸的含量测定。之前薛阿辉等采用HPLC法检测四季桂花中多酚类化合物，涉及40分钟的分析时间相反，本实验HPLC的总分析时间为11分钟，大大缩短了检测分析的时间。该方法的其他不可忽视的优点是在短时间内对7主要类黄酮和酚酸的同时测定。此外，HPLC-MS-MS程序与之前用紫外分光光度计和HPLC测定桂花的方法相比，灵敏度和选择性更高，本实验检测到桂花提取液中7种成分的含量为ng·ml-1级别。综上，本文用建立LC-MS-MS法同时测定三个不同品种桂花中绿原酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、芦丁、阿魏酸、槲皮素7种多酚类活性成分，并对不同品种桂花中多酚类活性成分的含量进行了分析，该方法简便，快速，灵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过HPLC‑MS‑MS法同时测定不同品种桂花中7种多酚类活性成分的含量的方法，其特征在于，本方法包括如下步骤：1)、制备供试品溶液：称取2.5g桂花粉末，加入80％乙醇溶液50mL，称重后，超声提取30min，自然放冷，称重，用浓度为80％的乙醇溶液补足失重，摇匀，过滤；吸取1mL提取液稀释5倍，使用0.22μm的微孔滤膜过滤，得到桂花供试品溶液，平行制得各组待测样品溶液5份，供HPLC‑MS‑MS分析用；2)、配制标准品溶液：用电子天平分别称取各标准品0.005g，分别用5mL甲醇完全溶解后得到质量浓度为1mg·mL‑1的单一标准品储备液；3)、设置HPLC‑MS‑MS分析条件：其中，色谱柱条件为：色谱柱型号为Shim‑packVP‑ODS2.0×150mm，柱温为30℃，流动相为甲醇‑0.1％甲酸，梯度洗脱的流速0.2mL/min，进样量为5μL；质谱条件为：电喷雾负离子模式，电喷雾电压为3.5kV，雾化气体为N2，雾化气流速为3L/min；离子源温度为250℃；碰撞气体为高纯氮气；碰撞气压力为230kPa；采用多反应检测扫描方式；4)、本测定方法中的方法学考察：精密度的考察：准确吸取混合对照品溶液，在同一天内重复进样6次，计算日内精密度RSD；稳定性的考察：取混合对照品溶液，室温放置，在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h进样分析，测定峰面积并计算RSD；重复性的考察：取丹桂样品6份，制作6组平行样品，进行平行实验测定并计算RSD值；加标回收率的考察：精密称取已测知7种物质含量的丹桂提取物共6份，分别加入适量混合标准品溶液，按步骤1)的方法准备样品进行分析，分别计算7种成分的平均回收率和RSD；线性关系的考察：取按照步骤2)的方法制备的对照品储备液适量，混合，再用甲醇水溶液稀释配制6个系列梯度浓度的混合对照品溶液；用步骤3)的HPLC‑MS‑MS方法进行检测；峰面积比值为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)，进行回归，以获得各成分在各自范围内的线性关系；样品中待测成分的含有量的测定：取3个品种的桂花按步骤1)的方法制备的供试品溶液，在步骤3)的色谱条件下测定。...

【技术特征摘要】
1.一种通过HPLC-MS-MS法同时测定不同品种桂花中7种多酚类活性成分的含量的方法，其特征在于，本方法包括如下步骤：1)、制备供试品溶液：称取2.5g桂花粉末，加入80％乙醇溶液50mL，称重后，超声提取30min，自然放冷，称重，用浓度为80％的乙醇溶液补足失重，摇匀，过滤；吸取1mL提取液稀释5倍，使用0.22μm的微孔滤膜过滤，得到桂花供试品溶液，平行制得各组待测样品溶液5份，供HPLC-MS-MS分析用；2)、配制标准品溶液：用电子天平分别称取各标准品0.005g，分别用5mL甲醇完全溶解后得到质量浓度为1mg·mL-1的单一标准品储备液；3)、设置HPLC-MS-MS分析条件：其中，色谱柱条件为：色谱柱型号为Shim-packVP-ODS2.0×150mm，柱温为30℃，流动相为甲醇-0.1％甲酸，梯度洗脱的流速0.2mL/min，进样量为5μL；质谱条件为：电喷雾负离子模式，电喷雾电压为3.5kV，雾化气体为N2，雾化气流速为3L/min；离子源温度为250℃；碰撞气体为高纯氮气；碰撞气压力为230kPa；采用多反应检测扫描方式；4)、本测定方法中的方法学考察：精密度的考察：准确吸取混合对照品溶液，在同一天内重复进样6次，计算日内精密度RSD；稳定性的考察：取混合对照品溶液，室温放置，在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h进样分析，测定峰面积并计算RSD；重复性的考察：取丹桂样品6份，制作6组平行样品，进行平行实验测定并计算RSD值；加标回收率的考察：精密称取已测知7种物质含量的丹桂提取物共6份，分别加入适量混合标准品溶液，按步骤1)的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈洪国，宋晓芳，
申请(专利权)人：湖北科技学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42