基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗及制备方法技术

本发明专利技术公开了基于纳米氧化石墨烯‑氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗及制备方法，制备方法为：(1)将纳米氧化石墨烯和硫酸铝加入到水中，搅拌，调节pH至7～8，反应，离心，收集固体，干燥，得到氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯；(2)将氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯和抗原蛋白加入到pH＝7.4磷酸盐缓冲液中，孵育，离心，收集固体，冷冻干燥，得到一种基于纳米氧化石墨烯‑氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗。本发明专利技术制备方法简单易行；抗原蛋白负载量高；在保留铝佐剂诱导体液免疫应答能力同时，通过氧化石墨烯进一步激活抗原特异性CD8

【技术实现步骤摘要】
基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗及制备方法
本专利技术涉及一种肿瘤疫苗的制备方法，尤其涉及一种基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗。
技术介绍
现代生物技术开发的新型疫苗，如核酸疫苗、多肽疫苗和抗独特型抗体疫苗等，多数不能激发CD8+细胞毒性T细胞免疫效应，成为绝大多数新型疫苗研发中的瓶颈问题。在肿瘤免疫治疗中，佐剂在重塑免疫类型，增强抗原特异性免疫应答等方面发挥着重要作用。目前临床上使用的佐剂(如：铝佐剂，水包油乳剂MF59)仅能引起体液免疫应答，难以诱导细胞免疫应答。铝佐剂是第一个被批准使用的佐剂，其安全性和有效性已被证实。虽然铝佐剂能引起强烈的体液免疫应答，但对于细胞免疫应答作用较小，因此，单独使用铝佐剂作为抗原载体难以对抗肿瘤等重大疾病。随着纳米技术的发展，生物纳米载体材料为疫苗开发提供了全新的思路。生物纳米载体材料具有良好的生物相容性和独特的理化性质，能够有效递送各种抗原，通过调控抗原在抗原提呈细胞内的呈递途径，在激发机体的体液免疫基础上，可以进一步激活抗原特异性的CD8+细胞毒性T细胞免疫反应，有望实现疫苗对肿瘤等重大疾病的有效预防或治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗。本专利技术的第二个目的是提供一种基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗的制备方法。本专利技术的技术方案概述如下：基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)按比例，将1g纳米氧化石墨烯和1～50g硫酸铝加入到100～1000mL水中，搅拌，滴加氢氧化钠水溶液调节pH至7～8，在20～30℃下反应2～24小时，离心，收集固体，干燥，得到氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯；(2)按比例，将1g氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯和0.5～5g抗原蛋白加入到100～1000mLpH＝7.4磷酸盐缓冲液中，在4～25℃下孵育0.5～6小时，调节温度至4～10℃，以10000～30000rpm转速离心10～30分钟，收集固体，冷冻干燥，得到一种基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗。抗原蛋白优选：卵清蛋白或小鼠黑色素瘤细胞B16裂解物，也可以选用其它抗原蛋白。上述方法制备的基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗。本专利技术的优点：本专利技术的肿瘤疫苗，制备方法简单易行；抗原蛋白负载量高；所述肿瘤疫苗在保留传统铝佐剂诱导体液免疫应答能力的同时，通过氧化石墨烯进一步激活抗原特异性CD8+细胞毒性T细胞免疫应答，可同时诱导产生体液免疫和抗原特异的细胞免疫应答，解决了传统多肽疫苗不能激活细胞免疫反应的技术问题，实现疫苗对肿瘤等重大疾病的有效预防或治疗。附图说明图1为实施例1制备的基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗粒径分布及扫描电镜图。图2为实施例1制备的基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗对荷E.G7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞模型小鼠的抑瘤效果曲线图(A)以及小鼠血清中抗OVA特异性抗体总IgG图(B)。图3为荷小鼠黑色素瘤细胞B16模型小鼠接种本专利技术实施例3制备的基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗后，小鼠脾脏内CD8+T淋巴细胞的比例分析。具体实施方式模拟蛋白卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)市售。小鼠黑色素瘤细胞B16，购买于2017年6月，中国，国家实验细胞资源共享服务平台(北京总部)，联系方式：http://www.crcpumc.com/小鼠黑色素瘤细胞B16裂解物的制备：收集对数期生长的小鼠黑色素瘤细胞B16，调整细胞浓度为1x107个/毫升，制备单细胞悬液。将单细胞悬液置于液氮中5分钟后取出，迅速转移到37℃水浴锅中孵育5分钟，振荡混匀以后，重新置于液氮中，此过程重复5次，反复吹打细胞至完全裂解，2000g离心15分钟，去掉细胞碎片，收集上清，即为小鼠黑色素瘤细胞B16裂解物。下面的实施例所用抗原蛋白包括蛋白卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)以及小鼠黑色素瘤细胞B16裂解物是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本专利技术，实验证明，凡是具有抗肿瘤的抗原蛋白，都可以用于本专利技术。下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)将1g纳米氧化石墨烯和25g硫酸铝加入到500mL水中，搅拌，滴加氢氧化钠水溶液调节pH至7.4，在25℃下反应12小时，离心，收集固体，干燥，得到氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯；(2)将1g氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯和2g卵清蛋白(OVA)加入到500mLpH＝7.4磷酸盐缓冲液中，在18℃下孵育3小时，调节温度至8℃，以15000rpm转速离心20分钟，收集固体，冷冻干燥，得到一种基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗。见图1和图2。图1为实施例1制备的基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗的粒径分布及扫描电镜图。所述粒径在300nm左右，粒径分布均匀，氧化石墨烯表面分布有氢氧化铝。图2是实施例1获得的一种基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/OVA抗原复合物的肿瘤疫苗对荷E.G7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞模型小鼠的抑瘤效果曲线图(A)以及小鼠血清中抗OVA特异性抗体总IgG图(B)。本实验中涉及到的E.G7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞，购买于2017年3月，中国，上海钰博生物科技有限公司，联系方式：https://shybio.biomart.cn。在该肿瘤模型小鼠中，OVA可以作为肿瘤抗原产生抗肿瘤免疫效应。图2A中显示了生理盐水组，游离抗原组，铝佐剂/抗原组，纳米氧化石墨烯/抗原组，纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原组(基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/OVA抗原复合物的肿瘤疫苗)。实验表明在相同抗原剂量下比较各组小鼠肿瘤体积发现，纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原组(基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/OVA抗原复合物的肿瘤疫苗)(168.78mm3±37.28mm3)，与生理盐水组(3687mm3±79.14mm3)，游离抗原组(2727mm3±73.44mm3)，铝佐剂/抗原组(2696mm3±75.13mm3)以及纳米氧化石墨烯/抗原组(1402.58mm3±49.09mm3)相比抑瘤效果显著；图2B表明，纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原(基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/OVA抗原复合物的肿瘤疫苗)组可以诱导产生较高水平的抗OVA特异性抗体总IgG。以上结果表明，本实施例获得的基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/OVA抗原复合物的肿瘤疫苗在保留传统铝佐剂诱导体液免疫应答能力的同时，可进一步激活细胞毒性T细胞的杀伤效应，有效抑制肿瘤生长。实施例2一种基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/OVA抗原复合物的肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)将1g纳米氧化石墨烯和50g硫酸铝加入到1000mL水中，搅拌，滴加氢氧化钠水溶液调节pH至8，在20℃下反应24小时，离心，收集固体，干燥，得到氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯；(2)将1g氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯和5g卵清蛋白(OVA)加入到1000mLpH＝7.4磷酸盐缓冲液中，在4℃下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于纳米氧化石墨烯‑氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗的制备方法，其特征是包括以下步骤：(1)按比例，将1g纳米氧化石墨烯和1～50g硫酸铝加入到100～1000mL水中，搅拌，滴加氢氧化钠水溶液调节pH至7～8，在20～30℃下反应2～24小时，离心，收集固体，干燥，得到氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯；(2)按比例，将1g氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯和0.5～5g抗原蛋白加入到100～1000mLpH＝7.4磷酸盐缓冲液中，在4～25℃下孵育0.5～6小时，调节温度至4～10℃，以10000～30000rpm转速离心10～30分钟，收集固体，冷冻干燥，得到一种基于纳米氧化石墨烯‑氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗。

【技术特征摘要】
1.基于纳米氧化石墨烯-氢氧化铝/抗原复合物的肿瘤疫苗的制备方法，其特征是包括以下步骤：(1)按比例，将1g纳米氧化石墨烯和1～50g硫酸铝加入到100～1000mL水中，搅拌，滴加氢氧化钠水溶液调节pH至7～8，在20～30℃下反应2～24小时，离心，收集固体，干燥，得到氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯；(2)按比例，将1g氢氧化铝修饰的纳米氧化石墨烯和0.5～5g抗原蛋白加入到100～1000...

【专利技术属性】
技术研发人员：马桂蕾，王晓莉，曹凤强，闫梦梦，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12