超顺磁性纳米磁珠革兰氏染色试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种超顺磁性纳米磁珠及其制备方法，还公开了一种革兰氏染色试剂盒及采用其的染色方法。本发明专利技术通过对纳米级四氧化三铁磁珠进行表面改性，使其具有良好的分散性和吸附性，进而将其制成染色试剂盒，利用磁珠吸附培养液中细菌的功能，使染色流程中省略灼烧镜检的步骤，可以通过观察染色剂溶出的颜色直接分辨菌种，缩短了鉴别时间，提高了鉴别准确度，减少了火灾安全隐患。

【技术实现步骤摘要】
超顺磁性纳米磁珠革兰氏染色试剂盒
本专利技术属于细菌染色鉴别领域，具体涉及一种超顺磁性纳米磁珠革兰氏染色试剂盒。
技术介绍
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种细菌鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。由于未经染色的细菌与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚观察细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。染色步骤包括结晶紫初染、碘液媒染、酒精脱色、沙黄复染四个步骤。传统的革兰氏染色法中需将灼烧涂片使细菌粘附固定，具有以下缺点：(一)耗时较长，火焰温度难以掌握，易出现固定不牢造成细菌冲洗时脱落或固定过度造成细胞通透性改变，出现假阴性结果，若涂片或染色不均匀时也会严重影响染色结果，致使难以判断阴阳性菌；(二)存在明显的安全隐患，细菌烘干与固定需要用到酒精灯，而玻璃酒精灯十分危险，容易造成烧伤烫伤事故，严重时还会引发实验室火灾；载玻片为玻璃制品边沿锋利，容易划伤皮肤；(三)操作难度大，涂片时是否能够涂均匀、染色时是否能够全部染色成功、脱色时间把握是否到位及镜检是否找到染色主体等都对实验员的操作有着较高要求，每一个操作步骤都会因实验人员水平不同而影响结果。因此，目前亟需解决的问题是提供一种鉴别准确、安全性高、操作快捷方便的革兰氏染色试剂盒及染色方法。
技术实现思路
为了克服上述问题，本专利技术人进行了锐意研究，结果发现：对纳米级四氧化三铁磁珠进行表面改性，使其具有良好的分散性和吸附性，进而将其制成染色试剂盒，利用磁珠吸附培养液中细菌的功能，使染色流程中省略灼烧镜检的步骤，可以通过观察溶液颜色分辨菌种，缩短了鉴别时间，提高了准确度，降低了操作难度，从而完成了本专利技术。具体来说，本专利技术的目的在于提供以下方面：第一方面，提供一种超顺磁性纳米磁珠，其中，所述纳米磁珠为表面改性的纳米四氧化三铁磁珠，其中，所述超顺磁性纳米磁珠的粒径为10～100nm，所述超顺磁性纳米磁珠的比饱和磁化强度为70～80emu/g。第二方面，提供一种超顺纳米磁珠的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：步骤1，制备纳米级的裸磁珠；步骤2，对纳米裸磁珠进行改性，制备得到超顺磁性纳米磁珠。第三方面，提供一种革兰氏染色试剂盒，包括上述方法制备的超顺磁性纳米磁珠，其中，所述试剂盒包括超顺磁性纳米磁珠悬浮液、染液、脱色液和显色液。第四方面，提供一种革兰氏染色方法，采用上述试剂盒进行，其中，所述方法包括以下步骤：步骤I，量取超顺磁性纳米磁珠悬浮液，加入待测菌液，对细菌进行固定；步骤II，对固定的细菌进行初染和媒染；步骤III，对初染和媒染后的细菌进行脱色处理；步骤IV，对脱色后的细菌进行复染；步骤V，对复染后的细菌进行显色处理，然后判断结果。本专利技术所具有的有益效果包括：(1)本专利技术制备的超顺磁性纳米磁珠，粒径小，分散性好，具有良好的吸附能力，可长期储存；(2)本专利技术所提供的革兰氏染色试剂盒，试剂种类少，检测迅速，检测成本低，安全性高；(3)本专利技术所提供的革兰氏染色试剂盒，改进革兰氏染色流程，用磁珠的吸附能力代替灼烧步骤，固定细菌，以观察染色后培养液颜色代替繁琐的显微镜观察步骤，操作简便；(4)本专利技术所提供的革兰氏染色方法，优化了染色步骤，进一步缩短了染色时间，可以根据使用情况应用不同染色方案，提高了适用范围。附图说明图1示出了本专利技术实施例1中超顺磁性纳米磁珠的粒径测量结果；图2中的a示出了本专利技术对比例4中纳米磁珠的电镜图片；图2中的b示出了本专利技术实施例1中纳米磁珠的电镜图片；图3中的曲线a示出了本专利技术实施例1中制备的纳米四氧化三铁裸磁珠的近红外光谱图；图3中的曲线b示出了本专利技术实施例1中制备的超顺磁性纳米磁珠的近红外光谱图；图4示出了本专利技术实施例1中制备的包被后的超顺磁性纳米磁珠电镜图片；图5示出了本专利技术实验例5中的菌中检测结果图。具体实施方式下面通过优选实施方式和实施例对本专利技术进一步详细说明。通过这些说明，本专利技术的特点和优点将变得更为清楚明确。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本专利技术人经过研究发现，纳米磁珠作为一种新型材料，由磁性内核与包裹在核外的特定基团构成，具有以下优点：比表面积大，固定效率高；机械强度高，耐酸碱腐蚀；生物相容性好，在吸附细菌的同时保护细菌结构不被破坏；超顺磁性保证磁珠可以被轻易富集或分离。本专利技术的第一个目的，提供一种超顺磁性纳米磁珠，其中，所述纳米磁珠为表面改性的纳米四氧化三铁磁珠，其中，所述超顺磁性纳米磁珠的粒径为10～100nm，所述超顺磁性纳米磁珠的比饱和磁化强度为70～80emu/g。根据本专利技术一种优选的实施方式，所述表面改性为采用多元碱盐改善纳米四氧化三铁磁珠的分散性能，和/或采用偶联剂改善纳米四氧化三铁磁珠的磁性。在进一步优选的实施方式中，所述多元碱盐为四甲基氢氧化铵和/或十六烷基三甲基溴化铵，和/或所述偶联剂为正硅酸乙酯、乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷或乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷中的一种或多种。在更进一步优选的实施方式中，所述表面改性采用四甲基氢氧化铵改善纳米四氧化三铁磁珠的分散性能，和/或采用正硅酸乙酯改善纳米四氧化三铁磁珠的吸附能力。优选地，在改善磁珠磁性时采用正硅酸乙酯与氨水的混合溶液，以增强改善效果。本专利技术的第二个目的，提供了一种超顺磁性纳米磁珠的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：步骤1，制备纳米级的裸磁珠。在本专利技术中，所述超顺磁性纳米磁珠的吸附主体为四氧化三铁，所述纳米级四氧化三铁裸磁珠的制备方法包括以下步骤：步骤1-1，将含Fe2+的铁盐和Fe3+的铁盐混合，然后加入氨水，充分反应，生成四氧化三铁。根据本专利技术一种优选的实施方式，所述含Fe2+的铁盐为FeSO4、FeCl2或Fe(NO3)2中的一种或多种，和/或所述含Fe3+的铁盐为Fe2(SO4)3、FeCl3或Fe(NO3)3中的一种或多种。在进一步优选的实施方式中，所述含Fe2+的铁盐为FeCl2，和/或所述含Fe3+的铁盐为FeCl3。根据本专利技术一种优选的实施方式，所述Fe3+与Fe2+的浓度比为(1.2～1.8)：1，优选为(1.4～1.5)：1。其中，磁珠粒径是决定其性质是否优良的重要物理指标。本专利技术人经过研究发现，当Fe3+与Fe2+的浓度比为(1.2～1.8)：1，优选为(1.4～1.5)：1时，制备得到的裸磁珠的粒径较小；当Fe3+与Fe2+的浓度比小于1.2:1时，制备的裸磁珠的粒径较大，当Fe3+与Fe2+的浓度比大于1.8:1时，随着Fe3+浓度的增加，制备的裸磁珠的粒径逐渐增大。根据本专利技术一种优选的实施方式，所述加入的氨水的摩尔浓度为0.25～0.75mol/L，优选为0.40～0.60mol/L，更优选为0.5mol/L。在本专利技术中，氨水浓度决定瞬时进入溶液的OH-浓度，本专利技术加入的氨水的摩尔浓度为0.25～0.75mol/L，优选为0.40～0.60mol/L，更优选为0.5mol/L，使得制备的磁珠的粒径较小。本专利技术人经过研究发现，当加入的氨水的摩尔浓度低于0.25mol/L时，会延长反应时间，增加Fe2+氧化及氨水变质的可能性，影响磁珠的磁性；当加入的氨水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超顺磁性纳米磁珠，其特征在于，所述纳米磁珠为表面改性的纳米四氧化三铁磁珠，其中，所述超顺磁性纳米磁珠的粒径为10～100nm，所述超顺磁性纳米磁珠的比饱和磁化强度为70～80emu/g。

【技术特征摘要】
1.一种超顺磁性纳米磁珠，其特征在于，所述纳米磁珠为表面改性的纳米四氧化三铁磁珠，其中，所述超顺磁性纳米磁珠的粒径为10～100nm，所述超顺磁性纳米磁珠的比饱和磁化强度为70～80emu/g。2.一种如权利要求1所述的超顺纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1，制备纳米级的裸磁珠；步骤2，对纳米裸磁珠进行改性，制备得到超顺磁性纳米磁珠。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述超顺磁性纳米磁珠的吸附主体为四氧化三铁，其制备方法包括以下步骤：步骤1-1，将含Fe2+的铁盐和Fe3+的铁盐混合，然后加入氨水，充分反应，生成四氧化三铁；步骤1-2，水浴搅拌步骤1-1中的反应液，使四氧化三铁熟化；步骤1-3，在外磁场条件下对熟化的四氧化三铁进行洗涤，然后烘干，制得纳米四氧化三铁裸磁珠。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1-1中，所述Fe3+与Fe2+的浓度比为(1.2～1.8)：1，优选为(1.4～1.5)：1；和/或所述加入的氨水的摩尔浓度为0.25～0.75mol/L，优选为0.40～0.60mol/L，更优选为0.5mol/L。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述改性为采用分散剂来改善纳米裸磁珠的分散性，采用修饰剂来改善纳米裸磁珠的吸附能力；优选地，所述改性包括以下子步骤：步骤2-1，制备纳米裸磁珠的悬浮液，然后向其中滴加分散剂，进行分散；步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯昱人，任滋禾，吴富华，陆韻，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11