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一种KRAS基因突变检测的新方法技术

技术编号:19770789 阅读:35 留言:0更新日期:2018-12-15 07:32
一种连接介导的环介导等温扩增对KRAS基因突变检测的新方法;包括以下步骤:(1)连接反应制备哑铃状模版:向连接酶的缓冲液加入连接探针,连接酶,KRAS突变序列后放入PCR仪进行连接,反应得到哑铃状模版;(2)将步骤(1)所得哑铃状模版与环介导等温扩增体系变性后加入染料及Bst酶混匀并置于实时荧光荧光PCR仪中反应,引物识别哑铃状模版并触发环介导等温扩增,实时监测荧光信号。本发明专利技术成功构建了用于监测实际样本中KRAS突变的荧光分析法,用本方法对KRAS突变样本中提取的基因组DNA进行检测,具有灵敏度高,特异性强,抗干扰能力强等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种KRAS基因突变检测的新方法
本专利技术涉及突变检测
,尤其涉及一种KRAS基因突变检测的新方法。
技术介绍
结直肠癌(colorectalcancer,CRC)是胃肠道中常见的恶性肿瘤,据世界卫生组织(WHO)统计,全球结直肠癌每年新发病例数约120万,年死亡人数达60余万。随着靶向治疗药物表皮生长因子受体抑制剂(epidermalgrowthfactorreceptorinhibitor,EGFRI)西妥昔单抗和帕尼单抗的问世,结直肠癌的治疗进入靶向治疗时代。而KRAS基因是影响肿瘤细胞对EGFRI响应性的重要预测性生物标志物。KRAS基因与CRC的关系密切,在CRC中的突变率为35%~45%。KRAS基因发生突变后,会导致表皮生长因子受体(EGFR)依赖的RAS-RAF-MAPK信号通路持续激活,引起细胞过度增殖和分化,从而诱发CRC。多个研究证实,肿瘤KRAS基因突变后对EGFRI(如西妥昔单抗、帕尼单抗)治疗不敏感。美国国立综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南2008年版已经指出:所有转移性结直肠癌患者均应进行KRAS基因检测,仅对KRAS基因野生型患者推荐接受EGFRI治疗。因此,临床上将KRAS基因突变状态作为一个重要的治疗标志物,它与结直肠癌的预后和治疗效果密切相关。目前检测KRAS基因突变的检测方法主要是直接测序法、高分辨率溶解曲线分析法、焦磷酸测序法、定量PCR法、突变扩增阻滞系统法等。直接测序法虽然是检测基因突变的金标准,但也存在着敏感性不够高、技术要求高、操作过程复杂、易造成交叉污染等明显缺点,且各级医院中往往无测序设备,需将标本送往相应的公司进行检测,耗费时间长、成本较高,故有很大的局限性。而焦磷酸测序的缺陷是检测成本高,测序样本制备单链DNA的过程较为繁琐。因此,发展一种可以灵敏度高、特异性好的检测方法可以有效提高KRAS突变基因的检出率,对早期诊断和临床指导用药具有较大意义。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点,本专利技术的目的在于提供一种KRAS突变检测方法,用于解决现有技术中突变检测成本较高,灵敏度低,特异性差等问题。为实现上述目的及其他相关目的,本专利技术提供了一种KRAS基因突变检测方法,包括如下步骤:(1)连接反应制备哑铃状模版:向连接酶的缓冲液加入连接探针,连接酶,KRAS突变序列后放入PCR仪进行连接反应得到哑铃状模版;(2)将步骤(1)所得哑铃状模版与环介导等温扩增体系混匀变性加入SYBRGreenI和BstDNApolymerase后置于实时荧光定量PCR仪中,使得引物识别并触发环介导等温扩增,实时监测荧光信号;如上所述,本专利技术的一种KRAS基因突变检测方法,具有以下有益效果:本专利技术成功构建了可以用于检测KRAS突变的荧光分析法,应用本专利技术对KRAS基因突变进行检测,具有灵敏性高、特异性好、抗干扰能力强等特点。与现有技术比较,本专利技术的成本低,操作简单方便,灵敏度高,不需要要昂贵的仪器,适用于临床实际样本的检测,为临床KRAS突变的检测提供了新的方法。附图说明图1A显示为本专利技术实施例中连接反应验证的PAGE电泳图。图1B显示为本专利技术实施例中连接反应验证的荧光图。图2A显示为本专利技术实施例中基于连接的环介导等温扩增反应的实时荧光曲线图。图2B显示为本专利技术实施例中基于连接的环介导等温扩增反应产物的琼脂糖电泳图。图3A显示为本专利技术实施例中不同浓度MutDNA检测结果的实时荧光曲线图。图3B显示为本专利技术实施例中检测结果标准曲线图。图4显示为本专利技术实施例中荧光传感器临床实际样本KRAS突变检测的特异性和准确性分析。具体实施方式实施例1构建荧光生物传感器并检测KRAS突变1、材料与方法1.1材料TaqDNAligase,BstDNApolymerase购于NEB(北京)有限公司。deoxynucleotidesolutionmixture(dNTPs)购于宝生物工程(大连)有限公司。nuclease-freeWater购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒购买于天根生化科技(北京)有限公司。HPLC纯化的DNA链均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成修饰。实验中所用到的临床标本来源于重庆医科大学附属第一医院。1.2检测仪器连接反应使用BIO-RADPCR仪完成,实时荧光强度由AppliedBiosystems实时荧光定量PCR仪进行监测。1.3检测方法概述设计两条茎环状的连接探针用于靶序列的识别,其中一条连接探针5’端修饰磷酸基团,另一条连接探针3’端修饰羟基。将连接探针,靶序列,TaqDNA连接酶及连接酶缓冲液混匀置于PCR仪中进行连接反应。靶序列作为连接模版与连接探针互补配对。在TaqDNA连接酶的作用下,将连接探针连接起来形成哑铃状模版。然后取连接产物加入环介导等温扩增体系,包括两条引物及缓冲液,dNTP。混匀后95℃变性3分钟后置于冰上,加入荧光染料SYBRGreenI和BstDNA聚合酶置于实时荧光定量PCR仪中65℃反应1小时。引物FIP可与哑铃状模版的环状部分杂交,在BstDNA聚合酶的链置换活性和聚合酶活性下进行环介导等温扩增,产生大量的DNA双链,荧光染料SYBRGreenI可特异地结合地结合到DNA双链上,产生可检测的荧光信号,由实时荧光定量PCR仪分析检测。2、连接反应表1连接反应体系组成表组分用量MutDNA/WtDNA1μL连接探针SLS11μL连接探针SLS21μLTaqDNALigase0.25μL10×TaqDNALigase缓冲液1μLnuclease-free水5.75μL总体积10μL为了更好地提高连接反应的连接特异性,使在MutDNA存在的情况下,茎环状的连接探针可以充分的连接,而野生型序列存在的情况下不能进行连接,首先将混匀后的连接反应体系95℃反应3分钟进行预变性,然后进行连接循环,63℃反应1分钟,95℃反应30秒,重复30个循环。使靶序列存在的情况下,磷酸化的连接探针的5’端与另一条连接探针的3’端连接形成哑铃状模版。所述连接探针其中一条为5’磷酸化的茎环状探针,具体序列为:5’-P-CAGCTCCAACTACCACAAGCGACAGCAGAGGATCCGCTCACACTTCCACACAACAAATCCTCTGCTGTCG-3’另一条茎环状连接探针序列为:5’-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACCAGTCACGACGATGCACTCTTGCCTACGCCAT-3’靶序列为:5’-AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCT-3’野生型序列为:5’-AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCT-3’3、环介导等温扩增表2环介导等温扩增反应体系组成表组分用量连接产物1μL引物FIP0.4μL引物BIP0.4μLdNTP0.5μL10×BstDNApolymerase缓冲液2μLnuclease-free水13.7μL总体积18.0μL为了更好地提高环介导等温扩增的反应效率,减少非特异的互补配对,使引物链与哑铃状模版充分结合,首先将本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种KRAS基因突变检测的新方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)连接反应制备哑铃状模版DSS:向连接酶的缓冲液中加入连接探针SLS1、连接探针SLS2、连接酶、KRAS突变序列MutDNA,混匀后放入PCR仪中95℃预变性3分钟,63℃反应1分钟,95℃反应30秒,30个连接循环反应后得到哑铃状模版;(2)将步骤(1)所得哑铃状模版与环介导等温扩增体系混匀并置于实时荧光定量PCR仪中,使得引物识别并触发环介导等温扩增,实时监测荧光信号;即设计两条茎环状的连接探针用于靶序列的识别,其中一条连接探针5’端修饰磷酸基团,另一条连接探针3’端修饰羟基,将连接探针,靶序列,Taq DNA连接酶及连接酶缓冲液混匀置于PCR仪中进行连接反应,靶序列作为连接模版与连接探针互补配对;在Taq DNA连接酶的作用下,将连接探针连接起来形成哑铃状模版,然后取连接产物加入环介导等温扩增体系,包括两条引物及缓冲液,dNTP,混匀后95℃变性3分钟后置于冰上,加入荧光染料SYBR Green I和Bst DNA聚合酶置于实时荧光定量PCR仪中65℃反应1小时,引物FIP可与哑铃状模版的环状部分杂交,在Bst DNA聚合酶的链置换活性和聚合酶活性下进行环介导等温扩增,产生大量的DNA双链,荧光染料SYBR Green I可特异地结合地结合到DNA双链上,产生可检测的荧光信号,由实时荧光定量PCR仪分析检测。...

【技术特征摘要】
1.一种KRAS基因突变检测的新方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)连接反应制备哑铃状模版DSS:向连接酶的缓冲液中加入连接探针SLS1、连接探针SLS2、连接酶、KRAS突变序列MutDNA,混匀后放入PCR仪中95℃预变性3分钟,63℃反应1分钟,95℃反应30秒,30个连接循环反应后得到哑铃状模版;(2)将步骤(1)所得哑铃状模版与环介导等温扩增体系混匀并置于实时荧光定量PCR仪中,使得引物识别并触发环介导等温扩增,实时监测荧光信号;即设计两条茎环状的连接探针用于靶序列的识别,其中一条连接探针5’端修饰磷酸基团,另一条连接探针3’端修饰羟基,将连接探针,靶序列,TaqDNA连接酶及连接酶缓冲液混匀置于PCR仪中进行连接反应,靶序列作为连接模版与连接探针互补配对;在TaqDNA连接酶的作用下,将连接探针连接起来形成哑铃状模版,然后取连接产物加入环介导等温扩增体系,包括两条引物及缓冲液,dNTP,混匀后95℃变性3分钟后置于冰上,加入荧光染料SYBRGreenI和BstDNA聚合酶置于实时荧光定量PCR仪中65℃反应1小时,引物FIP可与哑铃状模版的环状部分杂交,在BstDNA聚合酶的链置换活性和聚合酶活性下进行环介导等温扩增,产生大量的DNA双链,荧光染料SYBRGreenI可特异地结合地结合到DNA双链上,产生可检测的荧光信号,由实时荧光定量PCR仪分析检测。2.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测的新方法,其特征在于,所述连接探针SLS1与MutDNA之间有19个碱基互补配对,SLS...

【专利技术属性】
技术研发人员:闵迅付怡欣丁世家黄健周晓燕段晓雷袁建波
申请(专利权)人:遵义医学院
类型:发明
国别省市:贵州,52

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