本发明专利技术公开了一种肺腺癌检测试剂盒以及检测TULP2基因甲基化水平的方法。本发明专利技术的肺腺癌检测试剂盒包括如SEQ ID NO:1序列所示的TULP2基因正向引物、如SEQ ID NO:2序列所示的TULP2基因反向引物、如SEQ ID NO:3序列所示的甲基化探针、如SEQ ID NO:4序列所示的非甲基化探针；和实时荧光定量PCR检测试剂。本发明专利技术通过检测癌组织中TULP2基因甲基化水平与癌旁组织TULP2基因甲基化水平的差异，可以判断出待检测者患肺腺癌的风险。
【技术实现步骤摘要】
肺腺癌检测试剂盒及检测TULP2基因甲基化水平的方法
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种肺腺癌检测试剂盒及检测TULP2基因甲基化水平的方法。
技术介绍
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC/WHO)报道，2002年全球肺癌男性发病率为35.5/10万，发病97万人，死亡率为31.2/10万，死亡85万人；女性发病率为12.1/10万，发病39万人，死亡率为10.3/10万，死亡33万人。我国卫生部2008年4月公布的《第三次全国居民死亡原因调查》显示，在过去的30年中，我国肺癌发病率增量较大，已经取代肝癌成为首位恶性肿瘤死亡原因。根据WHO的病理学分析，肺癌分为四种主要组织类型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者还可进一步分为肺腺癌、磷状上皮癌和大细胞癌。为了对肺癌进行诊断，一般都综合运用多种方法。到目前为止，通过对肺部原发肿瘤以及转移性肿瘤(包括淋巴结及其它组织器官)进行病理活检并通过免疫组化方法进行分析是当前国际公认的诊断疾病的金标准。此外，还可以结合胸部X线摄影、胸部计算机断层扫描、纤维支气管镜等进行辅助诊断。与病理诊断相比，其它辅助诊断方法均有不同的缺陷与不足，如采用胸部计算机断层扫描，肺癌的大小必须达到0.1cm以上才能够进行测定，在这一时期，癌症很可能已经转移到了其它组织。因此，一种早期、有效诊断肺癌的方法十分必要。DNA甲基化(DNAmethylation)为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，是表观遗传学的一部分。在哺乳动物中，DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子的胞嘧啶环的5'碳上，DNA甲基化一般发生在占人类基因组约1％～2％的CpG位点上。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80％-90％的CpG位点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56％的哺乳动物基因中的启动子有关。人们发现表观遗传在肿瘤的发生发展过程中也起着重要作用，其中DNA甲基化水平改变是较早也是较为重要的表观遗传改变之一。DNA甲基化在肿瘤中的作用主要表现在以下几个方面：一是甲基化的CpG岛二核苷酸中的胞嘧啶以较高的频率脱氨基变成胸腺嘧啶，造成基因突变；二是抑癌基因和DNA修复基因由于超甲基化而沉默；三是癌基因甲基化水平降低而活化；四是基因组总体甲基化水平降低使转座子、重复序列活化导致染色体稳定性下降。这些因素是导致肿瘤发展、转移、恶化最终导致患者死亡的重要原因。DNA总体甲基化水平(即甲基化谱)和特定基因甲基化程度改变可作为肿瘤诊断指标。DNA甲基化与癌症的发生发展密切相关，因此研究与癌症发生发展相关的DNA甲基化具有重要的临床意义，特定基因启动子区域甲基化的甲基化状态可以作为癌症的临床诊断的辅助性标志来预测癌症的发生发展及预后。通过189例肺腺癌和149例正常人血液进行甲基化芯片检测，发现在肺腺癌血浆中TubbyLikeProtein2编码基因(即TULP2基因)的低甲基化状态可能与肺腺癌的发生、发展相关。可以作为肺腺癌早期诊断的一个特异性分子标记。检测TULP2基因的甲基化状态，对肺腺癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。传统精确检测精确位点的甲基化状态是通过重亚硫酸盐对DNA样品进行处理，对未甲基化修饰的胞嘧啶进行脱氨基反应，使其转化为磺化尿嘧啶，最后在氢氧化钠的作用下转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能够被重亚硫酸盐处理而保持不变。通过PCR等方法就能区分甲基化与非甲基化的胞嘧啶。该方法操作繁琐，处理时间长达16～18h，不适应与快速检测的需要。因此，需要开发新的TULP2基因甲基化检测试剂盒，以便更加高效精准的检测TULP2基因的甲基化状态。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中肺腺癌检测方法繁琐、处理时间长的技术问题，目的在于提供一种新的肺腺癌检测试剂盒，该肺腺癌检测试剂盒通过检测生物样品中TULP2基因甲基化水平来判断肺腺癌。申请人通过对20例肺腺癌人群癌组织和癌旁组织进行甲基化芯片检测，发现在肺腺癌癌组织中TubbyLikeProtein2(类桶状蛋白2)编码基因(TULP2)的低甲基化状态可能与肺腺癌的发生、发展相关。TULP2基因可以作为肺腺癌早期诊断的一个特异性分子标记，检测TULP2基因甲基化状态，对肺腺癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。本专利技术的肺腺癌检测试剂盒，包括如SEQIDNO:1序列所示的TULP2基因正向引物、如SEQIDNO:2序列所示的TULP2基因反向引物、如SEQIDNO:3序列所示的甲基化探针、如SEQIDNO:4序列所示的非甲基化探针；和，实时荧光定量PCR检测试剂。表1肺腺癌检测试剂盒的引物与探针R＝A/G所述实时荧光定量PCR检测试剂为DNA聚合酶预混液(MethyLightPCRKit)。所述DNA聚合酶预混液具体成分为：DNA聚合酶(Plus)、PCR缓冲液、dNTP混合液和荧光物质如ROX(羧基罗丹明)染料。所述TULP2基因正向引物的体积为1～3μL优选2μL，浓度为0.3～0.5μm优选0.4μm；TULP2基因反向引物的体积为1～3μL优选2μL，浓度为0.3～0.5μm优选0.4μm；甲基化探针的体积为0.4～0.6μL优选0.5μL，浓度为0.1～0.3μm优选0.2μm；和非甲基化探针的体积为0.4～0.6μL优选0.5μL，浓度为0.05～0.2μm优选0.1μm。所述DNA聚合酶预混液的体积25μL。本专利技术的另一目的在于提供一种检测TULP2基因甲基化水平的方法，该方法包括如下步骤：S1，提取生物样品中的DNA；S2，重亚硫酸盐转化提取到的DNA；S3，使用权利要求1所述的肺腺癌检测试剂盒实时荧光定量PCR扩增转化后的DNA，以检测TULP2基因甲基化水平。步骤S1中采用磁珠法提取血液样本中的DNA。实时荧光定量PCR扩增条件是预变性95℃30min循环1次；变性95℃10s，退火延伸56℃30s，循环50次。本专利技术通过检测可疑癌组织样本中TULP2基因甲基化水平，根据患者自身可疑癌旁组织TULP2基因甲基化水平，比较二者之间的差异，可以判断出待检测者患肺腺癌的风险；若可疑癌组织TULP2基因甲基化水平相对可疑癌旁组织的低，则患肺腺癌的风险高，若可疑癌组织TULP2基因甲基化水平相对来说高，则患肺腺癌的风险低。TULP2基因甲基化水平可以作为肺腺癌早期诊断的标志物，临床应用前景良好，对肺腺癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1为确诊肺腺癌癌组织与癌旁组织采用实时荧光定量PCR扩增检测TULP2基因甲基化水平比较图；图2为可疑肺癌患者采用实时荧光定量PCR扩增检测TULP2基因甲基化水平比较图；图3A为肺癌组织病理学检查结果(HE染色×200倍)；图3B为癌旁组织病理学检查结果(HE染色×200倍)。具体实施方式实施例1采集20例确诊为肺癌患者的癌组织和癌旁组织(由湖南省肿瘤医院提供)步骤S1磁珠本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肺腺癌检测试剂盒，其特征在于所述肺腺癌检测试剂盒包括如SEQ ID NO:1序列所示的TULP2基因正向引物、如SEQ ID NO:2序列所示的TULP2基因反向引物、如SEQ ID NO:3序列所示的甲基化探针、如SEQ ID NO:4序列所示的非甲基化探针；和实时荧光定量PCR检测试剂。
【技术特征摘要】
1.一种肺腺癌检测试剂盒，其特征在于所述肺腺癌检测试剂盒包括如SEQIDNO:1序列所示的TULP2基因正向引物、如SEQIDNO:2序列所示的TULP2基因反向引物、如SEQIDNO:3序列所示的甲基化探针、如SEQIDNO:4序列所示的非甲基化探针；和实时荧光定量PCR检测试剂。2.如权利要求1所述的肺腺癌检测试剂盒，其特征在于所述实时荧光定量PCR检测试剂为DNA聚合酶预混液。3.如权利要求1所述的肺腺癌检测试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶预混液具体为：DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP混合液和荧光物质染料。4.如权利要求1所述的肺腺癌检测试剂盒，其特征在于所述TULP2基因正向引物的体积为1～3μL优选2μL，浓度为0.3～0.5μm优选0.4μm；TULP2基因反向引物的体积为1～3μL优选2μL，浓度为0.3～0.5μm优选0.4μm；甲基化探针的体积为0.4～0.6μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈楠，杜白露，潘艺，莫茜，陶悦，周辉，马靖，殷敏智，顾松，徐敏，曹清，干驰，赵瑞珂，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心，
类型：发明
国别省市：上海,31
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