重组人胰岛素的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种重组人胰岛素的制备方法：以pET‑SUMO为载体，将SEQ ID No.2所示的核苷酸序列插入pET‑SUMO载体的EcoRI和HindIII酶位点之间，得到重组质粒；将重组质粒转入宿主菌中，在18‑37℃下在培养基中生长至OD600＝0.5‑0.7，诱导表达后，分离出Sumo‑胰岛素原融合蛋白包涵体；用含有尿素的缓冲液洗涤Sumo‑胰岛素原融合蛋白包涵体，离心后取沉淀，变性、梯度复性后，得到复性Sumo‑胰岛素原融合蛋白；利用Sumo蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶B在pH＝6.0‑8.0条件下一步酶切复性Sumo‑胰岛素原融合蛋白，酶切温度为16‑37℃，酶切时间为3‑6小时，得到重组人胰岛素。

【技术实现步骤摘要】
重组人胰岛素的制备方法
本专利技术涉及重组蛋白生产
，尤其涉及一种重组人胰岛素的制备方法。
技术介绍
胰岛素是由人体胰岛β细胞产生的，用于调节机体碳水化合物和脂肪代谢平衡的重要激素。作为首个被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的基因工程蛋白药物，重组人胰岛素在糖尿病临床治疗上具有重要用途且应用前景广泛。据世界卫生组织数据显示，全球目前共有糖尿病患者4亿2千万，另外还有1.6亿人处于糖尿病前期。在未来的20年，全球所需要的胰岛素消费将从目前的120亿美元增加至540亿美元。胰岛素属于短肽分子，由51个氨基酸组成，相对分子质量仅为5808道尔顿。然而，由于胰岛素分子结构复杂(由A、B两链经复杂的二硫键连接而成)，体外通过基因工程生产胰岛素的难度大、技术壁垒高、生产效率低。目前的胰岛素生产方式远不能满足临床上对胰岛素日益增长的需要，造成胰岛素价格昂贵，糖尿病的治疗成本高。因此，学术和工业界一直在探求更为简便和高效的重组人胰岛素的生产技术和工艺。重组人胰岛素可以通过三种基因工程表达系统来生产，即(1)动物或昆虫细胞表达系统；(2)大肠杆菌表达系统和(3)酵母表达系统。动物或昆虫细胞及酵母是真核细胞，虽然具有与蛋白折叠形成二琉键的能力，但该两种表达系统蛋白产量相对较低，操作难度较大、成本较高。而大肠杆菌则具有生长快速，生长周期短；易在分子水平上进行改造和修饰；培养基便宜；产量高。因此，在胰岛素生产工业上，大肠杆菌是目前应用最为广泛的表达系统。大肠杆菌表达系统虽然广泛应用于胰岛素生产工业上，但存在着严重的技术瓶颈问题。(1)大肠杆菌缺少真核细胞具有的蛋白翻译后的修饰能力，因此表达出来的目标蛋白通常会以不可溶的、无活性的包涵体形式存在。要使目标蛋白变为有活性，需要对来自包涵体的不溶蛋白在细胞外进行复杂的变性和复性的操作。(2)大肠杆菌细胞内存在大量的蛋白水解酶，使得表达的目标蛋白容易被降解，特别是胰岛素这样的小分子蛋白，其稳定性更差。为了解决胰岛素生产中的这两大关键问题，工业界一直不断地在探索胰岛素基因工程生产的新技术。其中，融合蛋白技术是探讨最多、目前应用最广的一种提高胰岛素生产效率的技术。其核心是指将目标蛋白(即胰岛素)与某一种高稳定性蛋白标签进行融合表达。目前，常用的融合蛋白标签包括：His，泛素，MBP(麦芽糖结合蛋白)，GST(谷胱苷肽S-转移酶)，硫氧还蛋白和Nusa标签等(见表1)。这些融合蛋白标签的应用可方便目标蛋白的分离纯化，并在一定程度上提高了胰岛素原蛋白在大肠杆菌内的稳定性，从而改善了重组胰岛素的生产效率。表1基因工程上常用的融合蛋白标签融合蛋白标签氨基酸数分子量(KDa)His60.84泛素768麦芽糖结合蛋白39640谷胱苷肽S-转移酶21126硫氧还蛋白10912Nusa标签49555然而，目前使用的融合蛋白技术并未能解决胰岛素生产中以下三个突出性技术难题：(1)不能显著提高胰岛素原蛋白在细胞外的变性复性效率；(2)需要在标签蛋白和胰岛素原(目的蛋白)之间设计特定的酶切位点(长度约10到20个氨基酸、具有特定序列的短肽)，以便在后续过程中通过蛋白酶切(如凝血酶、肠激酶)来释放目的蛋白。然而，这些酶切割以后通常会导致部分酶切位点氨基酸的残留，影响目的蛋白的生物功能；并且，切除这些融合标签所用的酶普遍存在着特异性差、切割效率低的问题；(3)经变性复性处理后的胰岛素原仍然需要经过三步酶切反应(即融合标签切割酶、胰蛋白酶和羧肽酶)才能获得有活性的胰岛素。因此，工业化生产胰岛素的过程仍然十分繁锁，生产效率很低，生产成本一直居高不下。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种重组人胰岛素的制备方法，构建了一种新的融合蛋白，该融合蛋白在宿主菌中具有高效的表达效率以及细胞外的高效变性复性效率，同时利用能特异性、并干净切除融合蛋白标签的“三合一”酶切反应体系，将胰岛素原转变为活性胰岛素，为胰岛素的高效、低成本工业化生产提供一种新的、更为简化的工艺流程。在一方面，本专利技术要求保护一种Sumo-胰岛素原融合基因，包括SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本专利技术的Sumo-胰岛素原融合基因，同时含有T7启动子、乳糖操纵子(Lac控制子)、胰岛素原基因和Sumo基因编码区，其中T7启动子为一大肠杆菌特异性的、具有高活性的转录启动元件；乳糖操纵子则为一条件性(诱导性)基因表过控制元件。当无诱导物存在时，阻遏物与操纵子(operator)结合使得结构基因不能正常转录，当诱导物(乳糖或IPTG)存在时，诱导物与阻遏物结合，使阻遏物从操纵基因上下来，使得基因转录正常进行。小分子类泛素修饰蛋白(Sumo)是一种顺序高度保守的真核生物蛋白，由100个氨基酸组成。Sumo在真核细胞中的主要功能是通过共价的方式与目的蛋白结合，从而影响它们的结构和活性。据文献报道，当作为蛋白标签融合到某些目标蛋白的N末端时，Sumo起到了促进原核生物中蛋白表达、增加重组蛋白可溶性和稳定性的作用。Sumo蛋白酶是一种能识别Sumo空间结构(而非特异的氨基酸序列)并对其进行正确切割的一种蛋白酶。将Sumo作为融合标签用于胰岛生产，至少有三方面的优势：(1)可使表达后的胰岛原蛋白较为稳定；(2)在变性复性过程中，可帮助胰岛原蛋白正确折叠，提高复性效率；(3)由于Sumo蛋白酶识别的是Sumo空间结构，而非特异的氨基酸序列，所以酶切去除Sumo后不会导致个别氨基酸在目标原蛋白胰岛原中的残留。在另一方面，本专利技术还要求保护一种Sumo-胰岛素原融合蛋白，其由上述Sumo-胰岛素原融合基因所编码。在又一方面，本专利技术还要求保护一种表达Sumo-胰岛素原融合蛋白的重组质粒，包括Sumo-胰岛素原融合基因，Sumo-胰岛素原融合基因包括SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本专利技术还要求保护一种重组人胰岛素的制备方法，包括以下步骤：(1)以pET-SUMO为载体，利用T4DNA连接酶将SEQIDNo.2所示的核苷酸序列插入pET-SUMO载体的EcoRI和HindIII酶位点之间，得到重组质粒；(2)将步骤(1)得到的测序正确的重组质粒转入宿主菌中，在18-37℃(优选为35-37℃)下在培养基中生长至OD600＝0.5-0.7(优选为OD600＝0.5)，然后加入0.5-2mM(优选为1mM)的IPTG诱导表达，诱导结束后，将菌液离心取沉淀物，分离出Sumo-胰岛素原融合蛋白包涵体；(3)用含有尿素的缓冲液洗涤所述Sumo-胰岛素原融合蛋白包涵体，离心后取沉淀，将沉淀用浓度为4-8M(优选为6-8M)的尿素变性液进行变性，离心后去上清液，使用浓度为6M-0.5M的包涵体复性液对上清液进行梯度复性，然后用PBS缓冲液重悬，得到复性Sumo-胰岛素原融合蛋白；(4)同时利用Sumo蛋白酶、胰蛋白酶和羧肽酶B在pH＝6.0-8.0(优选为7.5)条件下一步酶切复性Sumo-胰岛素原融合蛋白，酶切温度为16-37℃(优选为25℃-30℃)，酶切时间为3-6小时，得到重组人胰岛素。进一步地，在步骤(2)中，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。进一步地，在步骤(2)中，诱导表达时间为6小时。进一步地，在步骤(3)中，在尿素的缓冲液洗涤之前，还包括利用PB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Sumo‑胰岛素原融合基因，其特征在于：包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种Sumo-胰岛素原融合基因，其特征在于：包括SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2.一种Sumo-胰岛素原融合蛋白，其特征在于：其由权利要求1所述的Sumo-胰岛素原融合基因所编码。3.一种表达Sumo-胰岛素原融合蛋白的重组质粒，其特征在于：包括Sumo-胰岛素原融合基因，所述Sumo-胰岛素原融合基因包括SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。4.一种重组人胰岛素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以pET-SUMO为载体，利用T4DNA连接酶将SEQIDNo.2所示的核苷酸序列插入pET-SUMO载体的EcoRI和HindIII酶位点之间，得到重组质粒；(2)将步骤(1)得到的测序正确的重组质粒转入宿主菌中，在18-37℃下培养生长至OD600＝0.5-0.7，然后加入0.5-2mM的IPTG诱导表达，诱导结束后，将菌液离心取沉淀物，分离出Sumo-胰岛素原融合蛋白包涵体；(3)用含有尿素的缓冲液洗涤所述Sumo-胰岛素原融合蛋白包涵体，离心后取沉淀，将沉淀用浓度为4-8M的尿素变性液进行变性，离心后去上清液，使用浓度为0.5M-6M的包涵体复性液对上清液进行梯度复性，然后用PB...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙乔明，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32