家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子及其重组载体和应用制造技术

本发明专利技术涉及家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子及其重组载体和应用，该启动子是以BmNPV延迟早期基因39K的启动子最优序列作为“母体”启动子，逐步截短分析降低启动子长度，构建重组启动子，仍具有很强的BmNPV诱导启动活性，并验证家蚕核型多角体病毒立即早期基因IE‑1蛋白可以转录结合39K(‑310～‑355)区域诱导39K启动子表达，我们利用该区域构建了不同的人工合成诱导型启动子，能够高效提高39K及其他不同启动子诱导表达活性，该人工合成诱导型启动子不但适用于基因功能分析等分子生物学理论研究和家蚕核型多角体病毒表达系统应用研究，同时适用于利用基因工程技术进行的家蚕品种改良。

【技术实现步骤摘要】
家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子及其重组载体和应用
本专利技术属于生物
，涉及家蚕核型多角体病毒诱导型39k启动子，还涉及含有该启动子的重组载体和应用。
技术介绍
家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫。蚕丝业为世界经济、文化和社会发展做出了重要贡献。家蚕和家蚕核型多角体病毒作为高效表达外源蛋白的生物反应器，在生物工程领域具有重要的应用价值。天然启动子的低表达活性和非特异性在生物工程的应用中存在一定的局限性。在前期研究工作中，专利技术人所在课题组专利技术了BmNPV39K诱导型启动子(ZL201010231957.9)以及改造后的增强型En39K(ZL201310641709.5)。该启动子具有BmNPV诱导启动活性，能使细胞在受到BmNPV感染时启动外源基因的表达，但其启动子长度太长，核心调控区域未知，已不能满足现实需要。迫切需要在家蚕(鳞翅目)中构建高效的人工合成诱导型启动子满足不同生物工程需求。诱导型启动子是诱导型调控序列或诱导型增强子，是一组能在特定物理、化学或病原体信号刺激下增强外源基因表达的启动子。一般而言，诱导型启动子与转录激活子一样，以非活性形式存在，并可通过相应的信号刺激直接或间接激活。目前，诱导型启动子(Cre/LoxP、Tet-ON/Tet-OFF、蜕皮激素和病原体诱导系统)的几种技术方法被广泛应用于动植物基因工程领域，包括基因功能鉴定或品种改良。昆虫是地球上最大的生物类群。很多经济昆虫(如蚕和蜜蜂)具有非常重要的经济价值。然而，在昆虫基因工程研究中还没有一个较好的诱导系统，因此在抗病育种和基因治疗中构建致病诱导型启动子具有重要意义。人工合成的启动子是通过结合不同启动子元件的不同组合来构建更强的表达水平，并用启动子的不同组合替换或重新设计序列。植物中的合成启动子的研究相对较多，大多集中在合成诱导型合成启动子上。合成启动子主要是利用顺式调控元件来融合核心启动子。构建不同病原诱导型人工启动子可有效提高转基因抗病基因在植物抗病育种中的广谱性。或者，构建与组织特异性启动子(根、茎、叶等)和诱导型启动子结合的人工诱导启动子有助于特定组织诱导表达，以提高作物品质和提高作物抗性和抗病性。人工合成的启动子也被报道在动物，其构建方法主要是通过不同表达调控序列的同向组装，应用于靶向治疗疾病，以及外源基因的特异性组织表达。人工合成启动子在昆虫研究中才刚刚起步，特别是在昆虫疾病育种领域。在以前的研究中，筛选了BmNPV诱导启动子(VP1054、P33、BM21、BM122、39K、p143和p6.9)活性，发现39K启动子具有最高的BmNPV诱导的转录活性(ZL201010231957.9)。并使用HR3、H5、POLH和PU的增强子进一步增强BmNPV39K启动子的病毒诱导活性。可诱导的39K启动子控制的外源Hycu-ep32基因的过度表达在转基因品系中具有高的抗病毒能力。此外，我们构建了一个家蚕核型多角体病毒诱导的RNA干扰系统，它可以抑制BMNPV复制，受到病毒感染的严格控制，并且对宿主细胞没有毒性。并且高效的利用病毒诱导的39K启动子CRISPR/Cas9基因编辑系统，降低了潜在的靶效和高的编辑效率，增强了家蚕细胞的抗病毒能力。因此，为了使病毒诱导的39K启动子在基因功能研究、家蚕抗性育种和害虫防治中更有效，人工合成诱导型启动子在昆虫中是非常迫切的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子；本专利技术的目的之二在于提供家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子原件；本专利技术的目的之三在于提供人工合成家蚕核型多角体病毒诱导型启动子；本专利技术的目的之四在于提供所述人工合成家蚕核型多角体病毒诱导型启动子的重组表达载体；本专利技术的目的之五在于提供家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子或所述家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子原件在家蚕基因工程育种或家蚕核型多角体病毒表达系统中的应用；本专利技术的目的之六在于提供所述重组表达载体在家蚕基因工程育种或家蚕核型多角体病毒表达系统中的应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1、家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.2、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示。优选的，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。2、家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子原件，所述启动子原件核苷序列如SEQIDNo.3所示。3、人工合成家蚕核型多角体病毒诱导型启动子，其特征在于：含有如SEQIDNo.3所示的家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子原件和其它家蚕核型多角体病毒启动子序列。优选的，所述家蚕核型多角体病毒启动子为P33启动子，其核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。4、含有所述家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子或所述人工合成家蚕核型多角体病毒诱导型启动子的重组表达载体。可以在p39K-1启动子或启动子调控原件39K(-310～-355)的下游连接目的基因，包括结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因、能够干扰内源基因表达的小RNA等构建重组表达载体，在BmNPV感染或相关因子的诱导下驱动结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因、天然小RNA或人工合成小RNA的表达。优选方案一，所述重组表达载体为报告基因重组表达载体，所述报告基因由人工合成病毒诱导型启动子p39K-1或启动子调控原件39K(-310～-355)控制表达。报告基因包括但不限于：荧光素酶(FLUC)基因、红色荧光蛋白(DeRed)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因等。该重组表达载体家蚕核型多角体病毒诱导型启动子的相关研究。优选方案二，目的基因为家蚕抗性基因。优选方案三，目的基因为RNAi和基因编辑序列。所述重组表达载体能够在BmNPV感染或IE-1蛋白表达情况下激活表达。所述人工合成病毒诱导型启动子原件为39K(-310～-355)，所述39K(-310～-355)原件BmNPVIE-1蛋白结合原件，由BmNPV感染或IE-1蛋白表达控制表达。该启动子原件39K(-310～-355)可用于制备防治家蚕感染BmNPV的药物、家蚕抗BmNPV品系的基因工程育种以及诱导型家蚕核型多角体病毒表达系统。5、所述家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子或所述人工合成家蚕核型多角体病毒诱导型启动子在家蚕基因工程育种或家蚕核型多角体病毒表达系统中的应用6、所述重组表达载体在家蚕基因工程育种或家蚕核型多角体病毒表达系统中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术从BmNPV39K启动子母体启动子中获得，启动子长度降低为原来的39％，但启动子活性仍为原来的87％以上，同时我们获得了BmNPVIE-1蛋白结合启动子原件为39K(-310～-355)，可用于合成不同需要的人工合成启动子，提高基本启动子诱导活性；p39K-1或启动子调控原件39K(-310～-355)可以驱动外源基因在昆虫细胞或昆虫个体中经BmNPV感染或相关因子的诱导下高效表达，不但适用于基因功能分析等分子生物学理论研究，同时适用于利用基因工程技术进行的家蚕品种改良，特别适用于家蚕高效抗BmNPV品系的培育以及通过表达外源致死本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示。

【技术特征摘要】
1.家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.2、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示。2.根据权利要求1所述家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子原件，其特征在于：所述启动子原件核苷序列如SEQIDNo.3所示。4.人工合成家蚕核型多角体病毒诱导型启动子，其特征在于：含有如SEQIDNo.3所示的家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子原件和其它家蚕核型多角体病毒启动子。5.根据权利要求4所述人工合成家蚕核型多角体病毒诱导型启动子，其特征在于：所述家蚕核型多角体病毒启动子为P33启动子，其核苷酸序列如SEQIDNo.6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘敏慧，董战旗，鲁成，陈鹏，曹明亚，李海清，蒋亚明，胡志刚，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50