一种纳豆激酶液态发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种纳豆激酶生产方法，它包括：1）豆渣加水调至水分含量为80‑90%；2）按3‑10%接种量，接种活化的纳豆芽孢杆菌；3）36~38℃摇床培养30~40小时；4）离心取上清，上清液过滤除菌，得粗酶液；所得的粗酶液加入硫酸铵至饱和度达到50~90%，0~4℃静置10~20h，9000~10000rpm/min离心8~15 min，取沉淀，用缓冲溶液复溶，透析除盐，得到纳豆激酶；再与海藻糖麦芽糊精保护剂混合，喷雾干燥，得到纳豆激酶酶粉；本发明专利技术制备的纳豆激酶的比酶活可达到385.14 IU/mg，稳定性良好。

【技术实现步骤摘要】
一种纳豆激酶液态发酵方法
本专利技术属于食品加工领域，具体涉及一种纳豆激酶生产方法。
技术介绍
1987年，日本Sumi博士于纳豆中发现了一种能有效溶解心脏和大脑中血栓的酶—纳豆激酶（Nattokinase，NK），从此开始了对NK的应用与研究。纳豆激酶由食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产，是一种分子量远远小于UK、SK、tPA的蛋白质，是由纳豆在发酵过程中产生的丝氨酸蛋白酶，可将纤维蛋白水解成小肽和氨基酸，并具有良好的溶栓能力，且在降血压，预防心脑血管疾病等方面也具有一定疗效。目前医学上批准应用的溶栓药物有：链激酶（Streptokinase，SK）和尿激酶（Urkinase，UK）等，但它们均在一定程度上有某种缺陷，如药效时间短、易出血等。与现有的溶栓类药物相比，纳豆激酶源自传统食品，不仅价格低廉，安全性高，且纳豆激酶体内半衰期长，可被肠道吸收，不易引起出血，在体内作用迅速、持续时间长，还能激活体内的tPA，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性，因此受到了生物医学和食品界的广泛关注。近年来，国内市场上纳豆激酶胶囊种类繁多，但纳豆激酶的溶纤度和活性却相对较低。目前纳豆激酶主要有固态发酵和液态发酵两种方法。固态发酵是较为传统的发酵方法，产量低劳动强度大，液态发酵虽然提高了纳豆激酶的产量，但仍然不能满足需求。提高纳豆激酶产量主要方法有:（1）通过诱变，筛选，挑选高产纳豆激酶菌株；（2）优化发酵培养基及发酵条件；（3）运用基因工程技术获得高产酶工程菌。发酵获得纳豆激酶通过离心去除菌体，盐析除去杂蛋白，透析和超滤、凝胶柱等方法除盐来纯化酶液。纳豆激酶干燥方法主要有真空冷冻干燥和喷雾干燥等方法，真空冷冻干燥的纳豆激酶活力高，此外适宜的保护剂的添加也能更好的保持纳豆激酶活力，同时又能保证纳豆菌较高的存活率。豆渣是豆制品工业的主要副产物，目前国内大豆食品行业每年可产生几千万吨的湿豆渣，豆渣含有较多的多糖，膳食纤维，异黄酮，蛋白质等营养物质，是一种健康绿色的新型保健食品原材料。具有降低血压，减少脑血管疾病，改善糖尿病患者胰岛素水平。尽管营养作用被人们熟知，但豆渣含水量极高，黏度极大容易腐败，易污染环境，处理难度大。近年应用较多的豆渣加工方法有发酵处理法，螺杆挤压法，粉碎处理法等。但由于豆渣中膳食纤维化学结构中含有大量的亲水基团具有很高的结合水含量，在螺杆挤压法，粉碎处理法过程中需要耗费大量能量，毫无经济效益而言。而利用发酵法来处理豆渣生产一种产品如纳豆激酶，能够简化工艺，节约能源，降低生产成本，带来巨大的经济和社会效益。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种纳豆激酶生产方法。1、一种纳豆激酶生产方法，它包括：1）豆渣加水调至水分含量为80~90%，灭菌；2）按3~10%接种量，接种活化的纳豆芽孢杆菌；3）36~38℃摇床培养30~40小时；4）离心取上清，上清液过滤除菌，得粗酶液；4）干燥；步骤2）所述的接种量为8%；步骤2）所述的活化为：将纳豆芽孢杆菌粉，用无菌水溶解，稀释成10-3~10-6梯度，平板划线于含有2%琼脂的LB培养基上培养18h，然后挑取单菌落接入LB液体培养基中，活化三代，然后按3%接种量接于LB液体培养基中120rpm，37℃培养12h；菌液在高速冷冻离心机中，4℃、9500r/min离心10min；将离心后的菌体用无菌水洗涤两次，重悬，使菌悬液浓度调整至107CFU/mL；步骤1）所述的灭菌为121℃温度下灭菌20min；步骤3）所述的摇床培养在37℃温度下，培养36h；步骤4）所述的过滤为0.45～0.22µm的微孔滤膜过滤；步骤4）所述的纯化为加入硫酸铵至饱和度达到50~90%，0~4℃静置10~20h，9000~10000rpm/min离心8~15min，取沉淀，用缓冲溶液复溶，透析除盐；将透析后的纳豆激酶液，按体积比1:2~4加入海藻糖麦芽糊精混合保护剂，喷雾干燥，得纳豆激酶粉；所述的海藻糖麦芽糊精混合保护剂为：麦芽糊精6g、海藻糖12g，加入100mL蒸馏水；所述的体积比1:3。本专利技术目的是提供一种纳豆激酶生产方法，它包括：1）豆渣加水调至水分含量为80-90%；2）按3-10%接种量，接种活化的纳豆芽孢杆菌；3）36~38℃摇床培养30~40小时；4）离心取上清，上清液过滤除菌，得粗酶液；所得的粗酶液加入硫酸铵至饱和度达到50~90%，0~4℃静置10~20h，9000~10000rpm/min离心8~15min，取沉淀，用缓冲溶液复溶，透析除盐，得到纳豆激酶；再与海藻糖麦芽糊精保护剂混合，喷雾干燥，得到纳豆激酶酶粉；本专利技术制备的纳豆激酶的比酶活可达到385.14IU/mg，稳定性良好。附图说明图1纳豆芽孢杆菌显微镜形态；图2发酵单因素试验结果；图3不同培养基活菌数结果；图4不同培养基产纳豆激酶活性结果；图5盐析结果图；图6不同保护剂下冷冻干燥后纳豆激酶稳定性的比较结果；（a）海藻糖保护剂，（b）麦芽糊精保护剂，（c）乳清蛋白粉保护剂，（d）混合保护剂Ⅰ，（e）混合保护剂Ⅱ；图7不同保护剂下喷雾干燥后纳豆激酶稳定性的比较结果；（a）海藻糖保护剂，（b）麦芽糊精保护剂，（c）乳清蛋白粉保护剂，（d）混合保护剂Ⅰ，（e）混合保护剂Ⅱ。具体实施方式实施例1纳豆激酶粗酶液的制备1、发酵剂的制备购买纳豆芽孢杆菌粉，用无菌水溶解，稀释成10-3至10-6不同梯度平板划线于含有2%琼脂的LB培养基上培养18h进行镜检如图1，然后挑取单菌落接入LB液体培养基中，活化三代，然后按3%接种量接于LB液体培养基中120rpm，37℃培养12h；菌液在高速冷冻离心机中，4℃、9500r/min离心10min；将离心后的菌体用无菌水洗涤两次，重悬，使菌悬液浓度调整至107CFU/mL，作为发酵剂。2、发酵培养基的制备在室温下，按大豆与水质量比1:5浸泡13h，将水沥干，浸泡后的大豆与100℃的水在料理机中磨浆3min，过滤，得到新鲜豆渣，调整豆渣水分含量约为85%。将预处理后的鲜豆渣和水不同比例配置成液态发酵培养基。3、纳豆激酶粗酶液的制备发酵培养基放入半自动高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20min；冷却后按8%(v/w)的接种量接种107CFU/mL的纳豆芽孢杆菌发酵剂，然后放入设定好转速（160rpm）和温度（37℃）的摇床中培养至所需时间，取出发酵液以9500rpm、10min离心，用0.45µm和0.22µm的微孔滤膜除菌，收集去除菌体的上清液得到的纳豆激酶粗酶液，放入4℃冰箱保存。实施例2纳豆激酶液态发酵工艺优化一、纳豆激酶的发酵条件优化考察接种量、发酵温度、发酵时间、摇床转速、固液比五个因素对纳豆激酶活性的影响，得到其纳豆激酶最适酶活性的参数范围如图2，并在单因素试验基础上根据Box–Behnken原理对发酵时间，摇床转速，接种量三个主要因素进行响应面试验设计试验因素水平表见表1，试验结果见表2；通过单因素试验可以确定在37℃时酶活性达到最高，这与温度对菌体的代谢影响有关，温度低时菌体代谢慢，产酶少；而随着温度升高，代谢加快消耗营养物质也随着加快，同时高温容易使酶蛋白失活；固液比虽然在1:3时达到酶活最高，但是由于固形物所占比例过大，不利于工业生产，因此在固液比1:5时较为合理；因此选择发酵时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳豆激酶生产方法，它包括：1）豆渣加水调至水分含量为80~90% ，灭菌；2）按3~10%接种量，接种活化的纳豆芽孢杆菌；3）36~38℃摇床培养30~40小时； 4）离心取上清，上清液过滤除菌，得粗酶液，纯化；4）干燥。

【技术特征摘要】
1.一种纳豆激酶生产方法，它包括：1）豆渣加水调至水分含量为80~90%，灭菌；2）按3~10%接种量，接种活化的纳豆芽孢杆菌；3）36~38℃摇床培养30~40小时；4）离心取上清，上清液过滤除菌，得粗酶液，纯化；4）干燥。2.根据权利要求1所述的一种纳豆激酶生产方法，其特征在于：步骤2）所述的接种量为8%。3.根据权利要求2所述的一种纳豆激酶生产方法，其特征在于：步骤2）所述的活化为：将纳豆芽孢杆菌粉，用无菌水溶解，稀释成10-3~10-6梯度，平板划线于含有2%琼脂的LB培养基上培养18h，然后挑取单菌落接入LB液体培养基中，活化三代，然后按3%接种量接于LB液体培养基中120rpm，37℃培养12h；菌液在高速冷冻离心机中，4℃、9500r/min离心10min；将离心后的菌体用无菌水洗涤两次，重悬，使菌悬液浓度调整至107CFU/mL。4.根据权利要求3所述的一种纳豆激酶生产方法，其特征在于：步骤1）所...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴春红，胡洋，唐玉芳，王婧，崔阳，迟翰盛，王玉华，刘俊梅，于寒松，代伟长，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22