基于纳米TiO2低剂量诱导的细胞系及其制备方法与应用技术

技术编号:19770535 阅读:34 留言:0更新日期:2018-12-15 07:22
本发明专利技术公开了基于纳米TiO2低剂量诱导的细胞系及其制备方法与应用,基于人源正常细胞,经低浓度纳米TiO2长期刺激后筛选获得;该细胞系作为细胞模型来评价纳米TiO2的潜在毒性、致病作用或筛选降低纳米TiO2毒性的营养干预成分或药物,用于评估食品添加剂的安全性。

【技术实现步骤摘要】
基于纳米TiO2低剂量诱导的细胞系及其制备方法与应用
本专利技术涉及细胞生物学领域,具体地涉及一种通过纳米TiO2长期低剂量诱导制备的细胞系,用于评估食品添加剂的安全性。
技术介绍
目前,传统食品的安全性及毒理学研究主要通过动物实验来评估,但随着实验动物使用3R原则的倡导与实施、以及生物医学研究模式的转变,整体动物实验面临严峻挑战,替代动物实验的体外模型研究特别是基于体外培养的人源细胞模型已成为重要发展方向。纳米材料独特的纳米效应(尺寸效应、表面效应、量子效应、自组装等)使其毒性特征与相应的微米级材料明显不同,例如纳米材料可穿透生物屏障,透过生物膜上的孔隙进入细胞内或细胞器内,纳米材料易与生物大分子发生结合或催化化学反应,可能导致体内一些激素和重要酶系的活性丧失等。因此,即使传统公认安全的物质(GRAS),一旦以纳米形式存在,也可能引发新的潜在健康危害。纳米材料的安全性研究主要面临以下几个问题:⑴动物实验与人体的相关性不够确定,动物实验耗时长、投入大,不利于高通量检测未知化学物的毒性;⑵难以获取对纳米材料本身理化性质的全面掌握,目前很多研究仅着眼于特定尺寸特定条件下纳米材料的健康影响,忽略其理化性质如尺寸大小、表面面积、表面组成及电荷、形状等;⑶高浓度纳米材料暴露实验所获数据在毒理健康评估中的价值有限,人为的高浓度纳米环境并非真实的暴露量级;⑷已有评价方法大多是基于短期暴露研究,不利于判断纳米材料对个体的长期健康效应。传统的安全性评估技术不能完全适用于纳米材料,纳米形态物质的理化特性与其宏观状态时差异很大,意味着其毒代动力学及毒理学数据不能完全用宏观状态下的结果作参考。毒理学研究表明,体外高剂量暴露纳米TiO2颗粒于细胞中会引起细胞毒性、基因毒性与致癌性,体内高剂量暴露纳米TiO2颗粒会诱发炎症反应、基因毒性与致癌性。目前,纳米TiO2颗粒诱导癌症发生都是建立在高剂量暴露(远高于环境中的实际暴露浓度)的基础上,并不能反应环境中纳米TiO2暴露“低剂量、长期、蓄积性”等特点。
技术实现思路
为克服现有技术的上述缺陷,本专利技术的目的在于提供一种通过纳米TiO2长期低剂量诱导制备的细胞系,基于人源正常细胞,经低浓度纳米TiO2长期刺激后筛选获得,经鉴定发生稳定的细胞特性改变,该细胞系用于作为细胞模型来评价纳米TiO2的潜在毒性、致病作用或筛选降低纳米TiO2毒性的营养干预成分或药物,用于评估食品添加剂的安全性及其致癌效应、毒性作用。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现:第一方面,基于纳米TiO2低剂量诱导细胞系的方法,具体地,包括以下步骤:S1:源细胞复苏、培养、冻存;S2:将步骤S1处理后的源细胞于低剂量纳米TiO2暴露诱导、筛选,即得;其中,所述源细胞包括人正常细胞;所述纳米TiO2的暴露浓度为0.000001-2μg/mL,暴露时间为1-150天。优选的,所述人正常细胞为人支气管上皮正常细胞Beas2B。优选的,所述纳米TiO2的暴露浓度为0.000002-0.002μg/mL,暴露时间为30-150天。优选的,步骤S1中,所述源细胞复苏、培养、冻存的具体过程为:于液氮中取出冻存源细胞,迅速置于37℃水浴并不断晃动至源细胞快速融解;再将复苏后的源细胞转入培养皿中,加入培养基培养过夜,细胞贴壁后换液继续培养,待细胞生长至密度为90%时传代;然后选生长旺盛且状态好的细胞经PBS洗两次后,用胰酶消化至细胞变圆,用含10%胎牛血清培养基终止反应,800rpm离心5min,弃上清,加入冻存液,将上述细胞分装保存于-80℃超低温冰箱中,24h后转移至液氮中。在一些优选的实施方式中,所述培养基为RPMI-1640培养基,包括10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素;所述培养条件包括:空气和二氧化碳体积比为19:1(v/v),温度为37℃;所述冻存液包括10%DMSO和90%小牛血清。第二方面,通过上述基于纳米TiO2低剂量诱导细胞系的方法制得的细胞系。第三方面,上述细胞系在评估食品添加剂安全性方面的应用。与现有技术相比,本专利技术的有益效果在于:一、与正常内皮细胞相比,本专利技术构建的细胞系是经过长期低剂量化学物处理过的细胞系,已发生且呈现出与源细胞不同的细胞特征和表型改变,反映出纳米材料对细胞不同方面的作用以及对细胞转化进程的影响,可以直观反映纳米TiO2的长期生物学效应和潜在健康影响因素,既加强对纳米材料本身的表征研究,又能模拟真实暴露条件下的潜在毒性效应。二、传统方法中采用动物实验评估食品添加剂的安全性,利用小鼠,通过经口暴露(如灌胃)或经呼吸道(如鼻腔滴注)暴露纳米TiO2,一段时间后收集肺部内皮细胞,检测各项相关指标变化,该方法成本高、时间周期长且不可持续;本专利技术所用细胞系已经完成了前期的暴露工作,后续不需要再投入大量时间和成本;且本专利技术利用人源细胞系可以排除传统动物实验带来的物种差异,更能反映人体真实情况。附图说明图1为本专利技术低剂量纳米TiO2暴露150天后细胞增殖影响变化;图2为本专利技术不同剂量的纳米TiO2暴露150天对细胞形态影响变化照片;图3为低剂量纳米TiO2对Beas2B细胞吸收前后的电镜图;图4为低剂量纳米TiO2对Beas2B细胞迁移能力的影响;其中,A为Transwell实验,B为划痕试验,C为黏附能力。具体实施方式下面结合附图详细说明本专利技术的技术方案,但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1构建细胞系选择人支气管上皮正常细胞Beas2B作为源细胞,诱导筛选新的细胞系,具体步骤如下:于液氮中取出Beas2B细胞,迅速置于37℃水浴并不断晃动至Beas2B细胞快速融解;再将复苏后的Beas2B细胞转入培养皿中,加入包括10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的RPMI-1640培养基,在空气和二氧化碳体积比为19:1(v/v)、温度为37℃条件下培养过夜,Beas2B细胞贴壁后换液继续培养,待Beas2B细胞生长至密度为90%时传代;然后选生长旺盛且状态好的Beas2B细胞经PBS洗两次后,用胰酶消化至Beas2B细胞变圆,用含10%胎牛血清培养基终止反应,800rpm离心5min,弃上清,加入包括10%DMSO和90%小牛血清的冻存液,将上述Beas2B细胞分装保存于-80℃超低温冰箱中,24h后转移至液氮中;然后将上述处理后的Beas2B细胞于暴露浓度分别为0.000002μg/mL、0.002μg/mL、2μg/mL的纳米TiO2中暴露150天进行诱导,筛选即得新的细胞系。实施例2细胞生长曲线测定将培养状态良好的细胞用胰酶消化并计数,按照每孔200μL细胞悬液中含有4000个细胞的标准,将细胞均匀种于96孔版,96孔板四条边的微孔不种细胞,以培养液封。置于培养箱中37℃、5%CO2培养,6h后加入10uLCCK-8试剂,于细胞培养条件下孵育3-4h,于450nm处测定吸光度值,并连续4天在同一时间加入CCK-8试剂,同一时间测定450nm处吸光度值,并将第一天的吸光度值作为100%来标准化,将之后几天根据不同细胞第一天的吸光度值进行百分比标准化,并绘制生长曲线,参见附图1,为不同低剂量纳米TiO2对Beas2B细胞长期处理后Beas2B细胞增殖变化,可以看出随着暴露时间的增加,Beas2B细胞本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.基于纳米TiO2低剂量诱导细胞系的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:源细胞复苏、培养、冻存;S2:将步骤S1处理后的源细胞于低剂量纳米TiO2暴露诱导、筛选,即得;其中,所述源细胞为人正常细胞;所述纳米TiO2的暴露浓度为0.000001‑2μg/mL,暴露时间为1‑150天。

【技术特征摘要】
1.基于纳米TiO2低剂量诱导细胞系的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1:源细胞复苏、培养、冻存;S2:将步骤S1处理后的源细胞于低剂量纳米TiO2暴露诱导、筛选,即得;其中,所述源细胞为人正常细胞;所述纳米TiO2的暴露浓度为0.000001-2μg/mL,暴露时间为1-150天。2.如权利要求1所述基于纳米TiO2低剂量诱导细胞系的方法,其特征在于,所述人正常细胞为人支气管上皮正常细胞Beas2B。3.如权利要求1所述基于纳米TiO2低剂量诱导细胞系的方法,其特征在于,所述纳米TiO2的暴露浓度为0.000002-0.002μg/mL,暴露时间为30-150天。4.如权利要求1所述基于纳米TiO2低剂量诱导细胞系的方法,其特征在于,步骤S1中,所述源细胞复苏、培养、冻存的具体过程为:于液氮中取出冻存源细胞,迅速置于37℃水浴并不断晃动至源细胞快速融解;再将复苏后的源细胞转入培养皿中,加入培养基培养过夜,细胞贴壁后换液继续...

【专利技术属性】
技术研发人员:王慧巴乾贾旭东
申请(专利权)人:上海交通大学医学院国家食品安全风险评估中心
类型:发明
国别省市:上海,31

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