一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法技术

本发明专利技术提供一种人类原代培养细胞定点基因敲入方法，利用基于切口酶产生DNA单链缺口的技术，辅以一套同源重组修复因子RecOFAR来实现高效、精确、定点的人类原代培养细胞基因组编辑，包括定点基因敲入整合。本发明专利技术方法大幅度提高人类原代细胞基因组同源重组整合的效率（可达到20%以上），大大降低成本；本发明专利技术方法提高基因组编辑的安全性，有效降低靶位点处（on‑target）随机序列增删（indels)发生的频率，并且有效降低脱靶（off‑target)频率。

【技术实现步骤摘要】
一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人类原代培养细胞精确基因组编辑、定点基因敲入的方法。
技术介绍
随着全基因组测序技术的不断发展完善以及大型基因组注释项目的实施，生物科学的研究进入后基因组时代。在后基因组时代，基因组研究的重心将转向基因功能，即由测定基因的DNA序列、解释生命的所有遗传信息转移到从分子整体水平对生物学功能的研究上，在分子层面上探索人类健康和疾病的奥秘(PeltonenandMcKusick,2001)。科研人员们已经开始通过各种尝试，想要将基因组研究的成果尽早地运用到基础科学研究的各个领域，以及个性化医疗（personalizedmedicine）工作当中(ChanandGinsburg,2011)。不过面对海量枯燥的基因组信息，科研人员们该如何将这些数据转换成有意义的基因组功能,解决这个问题的一个关键在于尽快开发出一种高效率的、可靠的方法，来帮助科研人员研究基因型（genotype）对表型(phenotype）的影响作用。利用同源重组机制（homologousrecombination）对基因进行定向失活（Targetedgeneinactivation）就是这样一种好方法，可以帮助科研人员明确基因的功能(Capecchi,2005)。不过在实际工作中使用这种方法也会受到好几个因素，比如存在效率太低、费时费力、而且有可能导致突变等的限制。而RNA干扰技术（RNAinterference，RNAi）等基因靶向敲除技术则为科学家们提供了一种快捷、廉价而且可以开展高通量研究的新方法(Hannon,2002;McManusandSharp,2002)。不过RNAi这种基因敲除技术的敲除效果还不够彻底，每次试验以及每个实验室的试验结果都会有差异，另外还存在不可预知的脱靶情况（off-targeteffect），所以只能够用于需要暂时抑制基因功能的试验当中(Jacksonetal.,2003;JacksonandLinsley,2004)。近十年来出现了一种新的研究手段，可以帮助科研人员对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作。这种新技术就是我们常说的“基因组编辑技术（genomeediting）”，比如锌指核酸酶（Zinc-fingernucleases,ZFN）、转录激活因子样效应因子核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN）、基于成簇的规律间隔的短回文重复序列和Cas蛋白的DNA核酸内切酶（clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat(CRISPR)/Cas-basedRNA-guidedDNAendonucleases）等介导的基因编辑技术(Gajetal.,2013)。这些核酸酶能够对基因组进行人工修饰，其基本原理是在靶位点区诱发DNA双链缺口（double-strandbreaks,DSBs），然后启动非同源区的末端连接（NHEJ）DSB修复机制产生突变(Barnes,2001;Lieber,2010)或是利用同源重组（HR）修复机制(vandenBoschetal.,2002)完成我们所需要的各种人工修饰。在细胞内，乐观估计DSB自发产生的概率低于10-4，如果通过基因工程采用I-SceI(Choulikaetal.,1995;Bellaicheetal.,1999)、I-AniI(McConnellSmithetal.,2009)等归位内切酶（homingendonuclease）或FokI(Guoetal.,2010)、Cas9(Choetal.,2013)等核酸酶诱发DSBs，效率可提高至10%以上。但DSBs的产生会带来基因组的不稳定，包括在DSB附近局部产生indels，如随机的缺失、重排等，DSBs还可以在靶位点以外的其他区域产生不可预测的变化，因而导致染色体组不稳定性（chromosomalinstability）的发生(Pfeifferetal.,2000;Loetal.,2002)。即使在同源序列模板存在的情况下，DSB产生基因组破坏所诱发的反应主要以NHEJ为主，尽管有部分反应可以以具有同源序列的模板进行重组修复，因为indels的产生也将在同源重组修复中引入不可预测的突变(Kimetal.,2012)。因此利用制造DSB实现基因组精准定点改造的效率较低。本专利技术利用DNA序列上的协同nicks而非DSB诱发同源重组修复（HR）。DNA单链缺口（SSB或是nick）而非DSB介导的重组修复，可以避免DSB的种种不足。因为缺口只存在于DNA的单链本，所以产生indels的概率较低；同时因为有完整互补链的存在，染色体组不稳定性（chromosomalinstability）发生的概率也较低(Kimetal.,2012)。通常情况下，细胞通过BER机制（碱基断点修复）在nick原位进行修复；当细胞内存在同源序列时，同源重组反应得以以一定比例发生(DianovandHubscher,2013)。目前在序列特异的DNA区域诱发产生nicks有不同的策略，包括基因工程改造过的I-sceI、I-AniI、FokI、Cas9以及一些合成多核苷酸，如LNA、PNA等。由于单个nick诱发的同源重组概率可能比单个DSB本身低一个或几个数量级，所以在具体执行中，可以采用2个或多个nicks，在靶位点处协同诱发同源重组，提高重组效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法，利用基于切口酶产生DNA单链缺口的技术，辅以一套同源重组修复因子RecOFAR来实现高效、精确、定点的人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入整合。所述的同源重组因子RecOFAR为RecO、RecF、RecA、RecR组合联用，合称为RecOFAR。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：包括以下方法：A、野生型Cas9或Cas9n（D10A）及sgRNA的制备，但不局限于Cas9酶，还包括其他任何DNA单链切口酶；B、定位整合目标靶位点处潜在的nicks；C、设计外源供体DNA模板；D、制备并提供本专利技术体系的重组因子RecOFAR；E、利用电转人类原代培养细胞进行精确定点基因组编辑、基因改造；F、确定定点敲入整合KI效率；G、基因打靶on-targetindels和off-targetindels发生频率的检测。具体包括如下步骤：（1）野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列及sgRNA的制备野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列分别加入核定位序列(nucleuslocalizationsequence)，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽(capped)及加polyA的mRNA，以不同组合混合后-80℃冻存备用；sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到；（2）定位整合目标靶位点处潜在的nick选定nick位点，整合位点选在nick位点处或协本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法，其特征在于：利用基于切口酶产生DNA单链缺口的技术，辅以一套同源重组因子RecOFAR来实现高效、精确、定点的的人类原代培养细胞基因组编辑，包括定点基因敲入整合。

【技术特征摘要】
1.一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法，其特征在于：利用基于切口酶产生DNA单链缺口的技术，辅以一套同源重组因子RecOFAR来实现高效、精确、定点的的人类原代培养细胞基因组编辑，包括定点基因敲入整合。2.根据权利要求1所述的一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法，其特征在于：所述的同源重组因子RecOFAR为RecO、RecF、RecA、RecR组合联用，合称为RecOFAR。3.根据权利要求1所述的一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法，其特征在于：包括以下方法：A、野生型Cas9或Cas9n（D10A）及sgRNA的制备，但不局限于Cas9酶，还包括其他任何DNA单链切口酶；B、定位整合目标靶位点处潜在的nicks；C、设计外源供体DNA模板；D、制备并提供本发明体系中的重组因子群RecOFAR；E、利用电转人类原代培养细胞进行精确定点基因编辑、改造；F、确定定点敲入整合KI效率；G、靶位点处on-target以及脱靶off-target发生频率的检测。4.根据权利要求3所述的一种人类原代培养细胞定点基因敲入方法，其特征在于：具体包括如下步骤：（1）野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列及sgRNA的制备野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列分别加入核定位序列，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽及加polyA的mRNA，得到Cas9或Cas9n（D10A）mRNA，以不同组合混合后-80℃冻存备用；sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到；...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨宇丰，何小镇，陈文锋，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35