本发明专利技术公开了一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。该基因工程菌是将来自猕猴桃(Actinidia arguta)的芳樟醇合成酶基因LIS经优化后，转化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1f；在此基础上同时过表达内源HMG1、IDI1或ERG中的一种或多种基因。此外，通过对该基因工程菌发酵时添加的碳源如葡萄糖、甘油、果糖、柠檬酸以及丙酮酸及其浓度进行选择，进一步提高芳樟醇的产量。芳樟醇的产量最高能达到6.96mg/L，以及单位胞内芳樟醇含量939.04μg/g细胞干重(DCW)的极高产量。该基因工程菌能用于大规模商业化生产，前景良好。
【技术实现步骤摘要】
一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体地涉及一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。
技术介绍
芳樟醇结构中含有两个类异戊二烯基和十个碳原子，因其作为精油中的芳香物质和食品添加剂以及高级生物能源而被高度关注。芳樟醇作为开环单萜叔醇，是众多精油中的主要成分之一。花香中约有70％的萜类化合物以芳樟醇为代表。芳樟醇作为芳香和风味物质被添加到洗发水、香皂、沐浴露等化妆品中和家用洗涤剂中以及加工食品和饮料中。另外，芳樟醇也是生产维生素E、微生物A、法呢醇、香茅醇和紫罗兰酮等产物的关键前体。芳樟醇还具有抗真菌、细菌和杀虫剂的特性。当前，天然产物受到自然资源的限制产量普遍很低。作为植物的次级代谢产物，通常提取和分离都会对环境造成一定的污染并且成本很高。同时，大部分天然产物都具有几种异构体，并且结构复杂，传统的化学工艺合成可能无法满足纯度的要求。基于这些原因，利用微生物生产天然产物成为一个可行的选择，其合成途径见图1所示。一般通过外源引入芳樟醇合成酶基因生物发酵法生产芳樟醇，但目前在酿酒酵母中引入外源芳樟醇合成酶基因，其产量不高，仅为0.095mg/L(PegahAmirietal.,MetabolicengineeringofSaccharomycescerevisiaeforlinaloolproduction,BiotechnologyLetters,March2016,Volume38,Issue3,pp503–508)或0.127mg/L(孙明雪等，调控酿酒酵母类异戊二烯合成途径强化芳樟醇合成，生物工程学报，2013年6月23日，29(6)：751-759)，亟需高产芳樟醇的基因工程菌。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏高产芳樟醇的基因工程菌的不足，提供一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。本专利技术提供的技术方案如下：本专利技术的技术方案之一为：一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将经特殊优化的外源猕猴桃(Actinidiaarguta)芳樟醇合成酶基因(LIS)转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母构建而成，所述LIS的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；优选地，所述尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母Polf。优选地，基因工程菌还转化了内源基因，其中内源基因包括HMG1、IDI1和/或ERG；IDI1为单拷贝、双拷贝或三拷贝，ERG基因为ERG8、ERG10、ERG12、ERG19或ERG20F88W-N119W；HMG1、IDI1、ERG8、ERG10、ERG12及ERG19基因的核苷酸序列如基因库中所示；ERG20F88W-N119W的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。根据本专利技术，ERG20F88W-N119W是指ERG20基因的突变体，其在现有ERG20基因88位氨基酸F(苯丙氨酸)变为W(色氨酸)，119位氨基酸N(天冬酰胺)变为W(色氨酸)。更优选地，内源基因为HMG1；进一步更优选地，内源基因为组合1)HMG1和IDI1、2)HMG1和ERG、或3)HMG1、IDI1和ERG；其中ERG优选ERG12或ERG20F88W-N119W。本专利技术所述的重组载体为本领域常规的重组载体，其能够转化解脂耶氏酵母，基因均位于重组载体上；其中外源基因的重组载体为质粒pINA1312(简称p1312)；内源基因的重组载体为质粒pINA1312或pINA1269(简称p1269)。本专利技术的技术方案之二为：一种产芳樟醇的方法，其包括以下的步骤：培养如权利要求1～4任一项所述的产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌，添加十二烷进行两相发酵得发酵液，萃取发酵液的十二烷相；其中培养基为添加有碳源的YP培养基，碳源包括1)葡萄糖、柠檬酸、甘油和果糖中的一种、或者2)柠檬酸与选自葡萄糖、甘油和果糖中的一种或一种以上的组合；优选地，总碳源的终浓度为20g/L；更优选地，碳源为柠檬酸和果糖；进一步更优选地，柠檬酸和果糖的浓度均为10g/L；其中单位L为添加碳源后培养基的总体积。优选地，碳源为柠檬酸和丙酮酸；较佳地，丙酮酸的浓度为2～8g/L，柠檬酸浓度为20g/L；其中单位L为添加碳源后培养基的总体积。本专利技术的技术方案之三为：一种用于培养上述解脂耶氏酵母基因工程菌的培养基，其是于YP培养基中添加碳源，其碳源至少包括柠檬酸；优选地，其碳源还包括1)葡萄糖、甘油或果糖中的一种，或2)丙酮酸；更优选地，其碳源为柠檬酸和果糖，柠檬酸和果糖的浓度各为10g/L；或更优选地，当碳源为柠檬酸和丙酮酸时，丙酮酸的浓度为2～8g/L，柠檬酸浓度为20g/L；其中单位L为添加碳源后培养基的总体积。YP培养基即传统的YPD培养基去除20g/L葡萄糖，其成分包括：10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨。YP培养基制成后高温121℃20分钟灭菌，在超净台中按比例加入经灭菌的上述各种碳源。本专利技术的技术方案之四为：本专利技术上述的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备芳樟醇中的应用。本专利技术的技术方案之五为：一种制备上述的解脂耶氏酵母基因工程菌的方法，其包括以下的步骤：(1)构建含有猕猴桃LIS的重组载体p1312-LIS；(2)将步骤(1)制备的重组载体转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，得转化体。较优选地，还包括以下的步骤：(3)将HMG1和/或IDI1单独或共构建到质粒p1269中，ERG8、ERG10、ERG12、ERG19和ERG20F88W-N119W单独构建或与其它基因共构建到质粒p1269或p1312中；(4)将上述(3)中的质粒转化步骤(2)所得的转化体。本专利技术的技术方案之六为：一种用于制备上述的解脂耶氏酵母基因工程菌的重组载体，其在质粒p1312上含有猕猴桃LIS，猕猴桃LIS的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。较优选地，在质粒p1312或p1269上还含有内源基因HMG1、IDI1和/或ERG；较优选地，上述ERG基因为ERG8、ERG10、ERG12、ERG19或ERG20F88W-N119W；上述ERG20F88W-N119W的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术通过在解脂耶氏酵母中导入来源于猕猴桃的基因LIS，并导入内源基因HMG1、IDI1和ERG中的一种或一种以上，在此基础上过表达基因LIS、HMG1、和/或ERG，获得能更大幅度地提高芳樟醇的产量的产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌。该产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌能使芳樟醇产量最高达到5.34mg/L，在添加柠檬酸、甘油、果糖和/或丙酮酸以后，芳樟醇产量最高达到6.96mg/L，超过仅导入基因LIS的菌株所产芳樟醇(0.09mg/L)的产量76.3倍。此外，利用本专利技术提供的解脂耶氏酵母基因工程菌产芳樟醇的方法，操作简便，反应稳定可靠，能够利用于大规模的商业化生产，所得的芳樟醇能够安全地用于食品添加剂的制备，前景良好。附图说明图1为本专利技术芳樟醇在解脂耶氏酵母中的合成途径。图2为重组质本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)基因工程菌，其特征在于，其是将经优化的外源猕猴桃(Actinidia arguta)芳樟醇合成酶基因(LIS)转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母构建而成，所述LIS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；较佳地，所述解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母Polf。
【技术特征摘要】
1.一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)基因工程菌，其特征在于，其是将经优化的外源猕猴桃(Actinidiaarguta)芳樟醇合成酶基因(LIS)转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母构建而成，所述LIS的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；较佳地，所述解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母Polf。2.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，还转化了内源基因，所述内源基因为HMG1、IDI1和/或ERG；所述IDI1为单拷贝、双拷贝或三拷贝，所述ERG基因为ERG8、ERG10、ERG12、ERG19或ERG20F88W-N119W中的一种，其中所述ERG20F88W-N119W的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。3.如权利要求2所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述内源基因为HMG1；较佳地，所述内源基因为组合1)HMG1和IDI1、2)HMG1和ERG、或者3)HMG1、IDI1和ERG；更佳地，所述ERG为ERG12或ERG20F88W-N119W。4.如权利要求1～3任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因均位于重组载体上；其中所述的外源基因的重组载体为质粒pINA1312；所述的内源基因的重组载体为质粒pINA1312或pINA1269。5.一种产芳樟醇的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：培养如权利要求1～4任一项所述的解脂耶氏酵母基因工程菌，添加十二烷进行两相发酵得发酵液，萃取发酵液的十二烷相；其中培养基为添加有碳源的YP培养基，所述碳源包括1)葡萄糖、柠檬酸、甘油和果糖中的一种、或者2)柠檬酸与选自葡萄糖、甘油和果糖中的一种或一种以上的组合；较佳地，总碳源的终浓度为20g/L；更佳地，所述的碳源为柠檬酸和果糖；进一步更佳地，柠檬酸和果糖的浓度均为10g/L；所述单位L为添加碳源后培养基的总体积。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：花强，韦柳静，曹选，林嘉宇，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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