脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法技术

本发明专利技术公开了脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，该种方法通过对细胞亚群的建立和分离，以及体内和体外的检测试验，体外包括免疫荧光法、流式细胞术、ELISA实验、Transwell实验、CCK8测试、划痕试验、Adhesion assay和血管生成试验，通过多种手段和方向对细胞亚群的生物特性进行逐步确定，为肿瘤靶向治疗提供了非常好的技术支持和根据；同时通过基因技术对细胞亚群的RNA进行差异性检测，从而可以对治疗靶点的确定提供了很好的帮助。

【技术实现步骤摘要】
脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法
本专利技术涉及细胞检测
，具体涉及脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法。
技术介绍
脑胶质瘤是起源于脑部神经胶质细胞，是最常见的颅内肿瘤，约占所有颅内肿瘤的45%左右。在儿童恶性肿瘤中排第二位，近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率约为1.2%，中老年人群尤为明显。中国脑胶质瘤年发病率为3-6人/10万人，年死亡人数达3万人。脑胶质瘤在发生之初，通常没有典型的症状。随着肿瘤的不断增大，会表现出如下症状：一是颅内压增高和其他一般症状，如头痛、呕吐、视力减退、复视、癫痫发作和精神症状等。另一是脑组织受肿瘤的压迫、浸润、破坏所产生的局部症状，局部症状依肿瘤生长位置不同而异。胶质瘤系浸润性生长物，它和正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，非常容易复发，生长在大脑等重要部位的良、恶性肿瘤，手术难以切除或根本不能手术。化学药物和一般抗肿瘤的中药，因血脑屏障等因素的影响，疗效也不理想，因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。间充质干细胞是干细胞的一个研究分支，干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的始祖细胞。一类存在于多种组织，具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能，细胞模型被应用于增殖、移植和分化研究，以及体外的免疫反应的鉴定。胶质瘤的生长和快速繁殖与肿瘤内某种特异性细胞有关，所以对该种特异性细胞的生物特性的检测、确定在肿瘤医学研究中尤为重要，由于肿瘤的形成和生长因素和诱因非常复杂，需通过大量实验进行方法的筛选和优化才能确定肿瘤中不同细胞亚群具有的不同特性，因为不同生物特性对肿瘤的发展具有不同的促进作用，所以当这种细胞亚群的生物特性被确定后，会给肿瘤的靶向研究带来深远的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出脑胶质瘤相关间充质干细胞（glioma-associatedmesenchymalstemcells，gbMSCs）亚群生物特性的检测方法，通过对CD90highgbMSCs和CD90lowgbMSCs两种细胞亚群进行体内和体外测试，确定其生物特性，为脑胶质瘤的医学治疗和研究提供了更有效的方法。本专利技术提出脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，包括以下步骤：（1）脑胶质瘤相关间充质干细胞的CD90high和CD90low两种细胞亚群采用免疫磁珠分离实验进行体外筛选分离，培养，鉴定；（2）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群分别进行体外检测，包括CCK8实验、Transwell实验、细胞划痕实验、Adhesionassay和促内皮细胞成管实验；（3）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群分别进行动物体内对比实验，包括肿瘤大小，动物生存期，肿瘤组织内Ki-67和CD31表达；组织内CD90和CD105双标荧光免疫表达，生物信息学分析CD90表达和TCGA数据库内GBM患者预后；（4）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群通过基因芯片技术进行差异性表达测试，同时通过ELISA实验对分泌生长因子进行测试。本专利技术采用了体内和体外分别对CD90highgbMSCs和CD90lowgbMSCs两种细胞亚群两种进行了实验研究，这样可以更有效的增加了实验结果的真实性和有效性。通过对肿瘤标本的处理培养后，再采用免疫磁珠分离实验对细胞进行标记分离，最后分别得到CD90highgbMSCs和CD90lowgbMSCs两种细胞亚群。鉴定后进行分离培养以备体内和体外实验使用。本专利技术采用CCK8实验和Transwell实验对CD90high和CD90low两种细胞亚群的促胶质瘤增殖能力和迁移能力进行测试，促胶质瘤增殖能力和迁移能力越强，说明该种细胞对肿瘤发展的正向促进作用、活跃能力以及促生成能力就越强。同时，本申请中还通过使用细胞划痕实验进一步的测定了两种细胞亚群的迁移能力。本专利技术通过Adhesionassay来对CD90high和CD90low两种细胞亚群的细胞粘附性测试，细胞与细胞以及细胞与基质之间的粘附作用是细胞信号传递以及多种细胞生物活动的基础，是研究细胞生物特性的关键性指标。血管新生，是指新生毛细血管自成体血管出芽形成的复杂过程，包括内皮细胞的活化、迁移和增生。该过程对于正常生长发育、生殖、修复以及成血管性疾病（如关节炎、银屑病、血管瘤、糖尿病视网膜病)和肿瘤性疾病是必不可少的。血管新生是在一系列有着广泛相互作用的细胞和分子的共同调节下完成的。在血管出芽前，首先发生血管通透性增高和毛细血管基底膜的降解，随之趋化因子和丝裂原被激活以促进内皮细胞的迁移和增殖，最后是管状结构和基底膜的重建。基底膜的形成，标志着血管成熟的开始，主要是内皮细胞对周细胞的募集，从而形成有周细胞包绕的稳定的血管。具有中层的较大血管的形成还需要合适的信号以完成血管平滑肌细胞的募集。周细胞是调节血管形成、稳定和功能的关键因素。周细胞和内皮细胞间的相互作用在血管新生中具有极为重要的作用。本申请通过促内皮细胞成管实验后，用荧光显微镜进行拍照记录，采用ImageJ进行了管状结构长度的分析。检测两种亚群的促血管生成能力。免疫荧光法是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。该方法可对确定是否发生周细胞分化以及分化后的定量分析。miRNA修饰检测是通过基因技术来确定体外分化常规培养液和肿瘤条件培养液培养的血管周细胞miRNA的匹配和比对情况；体外分化后的细胞基因与体内成熟肿瘤血管细胞基因的比对，从基因的层面对周细胞分化加以证明；同时通过基因测序等技术可以确定基因被修饰的细胞，可以作为今后治疗研究的靶点。ELISA检测的细胞因子为VEGF、bFGF、SDF-1α、CCL5、MMP9和IL-6。癌细胞的生长、转移依赖新生血管的形成，血管内皮生长因子（VEGF)是最有效的促血管生长因子。bFGF的生物学效应分体内和体外两大部分。体内作用十分强烈，成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、肾上腺皮质和髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等具有很强的促细胞分裂增殖活性。SDF-1α和CCL5为趋化因子，趋化因子的主要作用是趋化细胞的迁移。细胞沿着趋化因子浓度增加的信号向趋化因子源处的迁徙。有些趋化因子在免疫监视过程中控制免疫细胞趋化，如诱导淋巴细胞到淋巴结。这些淋巴结中的趋化因子通过与这些组织中的抗原提呈细胞相互作用而监视病原体的入侵。这些被称为稳态趋化因子，其产生无需刺激而分泌。有些趋化因子在发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）脑胶质瘤相关间充质干细胞的CD90high和CD90low两种细胞亚群采用免疫磁珠分离实验进行体外筛选分离，培养，鉴定；（2）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群分别进行体外检测，包括CCK8实验、Transwell 实验、细胞划痕实验、Adhesion assay和促内皮细胞成管实验；（3）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群分别进行动物体内对比实验，包括肿瘤大小，动物生存期，肿瘤组织内Ki‑67和CD31表达；组织内CD90和CD105双标荧光免疫表达，生物信息学分析CD90表达和TCGA数据库内GBM患者预后；（4）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群通过基因芯片技术进行差异性表达测试，同时通过ELISA实验对分泌生长因子进行测试。

【技术特征摘要】
1.脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）脑胶质瘤相关间充质干细胞的CD90high和CD90low两种细胞亚群采用免疫磁珠分离实验进行体外筛选分离，培养，鉴定；（2）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群分别进行体外检测，包括CCK8实验、Transwell实验、细胞划痕实验、Adhesionassay和促内皮细胞成管实验；（3）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群分别进行动物体内对比实验，包括肿瘤大小，动物生存期，肿瘤组织内Ki-67和CD31表达；组织内CD90和CD105双标荧光免疫表达，生物信息学分析CD90表达和TCGA数据库内GBM患者预后；（4）将脑胶质瘤相关间充质干细胞CD90high和CD90low两种细胞亚群通过基因芯片技术进行差异性表达测试，同时通过ELISA实验对分泌生长因子进行测试。2.如权利要求1所述脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法，其特征在于：所述脑胶质瘤相关间充质干细胞还进行细胞分化培养实验。3.如权利要求2所述脑胶质瘤相关间充质干细胞亚群生物特性的检测方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：付朋，赵洪洋，项炜，熊南翔，姜晓兵，张方成，张庆，易东晔，蔡晓立，薛冰洲，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42