纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法技术

本发明专利技术公开纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，包括如下步骤：(1)将第一单克隆抗体偶联于第一磁性纳米酶颗粒上，获得捕获探针；(2)将第二单克隆抗体偶联于第二磁性纳米酶颗粒上，获得检测探针；(3)将待测样品与捕获探针温育；(4)从步骤(3)的溶液中得到捕获探针‑抗原复合物；(5)重悬捕获探针‑抗原复合物，加入检测探针，温育；(6)从溶液步骤(5)的溶液中得到捕获探针‑抗原‑检测探针复合物；(7)加入过氧化物和催化底物显色，通过酶联仪检测溶液的光吸收值；(8)测量已知浓度的生物分子，绘制标准曲线，从而获得待测生物样品中的抗原含量。该方法操作步骤简单快捷，且对环境友好，适合各种化学或生物分子的检测。

【技术实现步骤摘要】
纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法
本专利技术涉及纳米材料及生物医学纳米
更具体地，涉及一种纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法。
技术介绍
随着纳米技术的快速发展，纳米材料特别是磁性纳米颗粒在生物医学领域引起了人们极大的研究兴趣。磁性纳米颗粒是一类智能型的纳米材料，既具有纳米材料所特有的性质，如粒径小、比表面积大、偶联容量高，又具有磁响应性及超顺磁性，可以在恒定磁场下聚集和定位、在交变磁场下吸收电磁波产热。利用这些特性磁性纳米颗粒被应用于生物标记与分离、核磁共振成像、组织修复、药物载体以及疾病诊断与治疗等方面。近年，阎锡蕴课题组发现磁纳米颗粒具有过氧化物酶的催化功能(NatureNanotechnology.2007)并研制了三功能(识别、催化、磁性)于一体的新型检测试剂，发现磁颗粒表面包裹蛋白分子后仍然具有酶活性(阎锡蕴等，NatureNanotechnology.2012)。这种催化活性与辣根过氧化物酶相似，在过氧化氢存在下，磁性纳米颗粒可以催化辣根过氧化物酶的底物，如可以催化3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)生成蓝色的产物，催化二氨基联苯胺(DAB)生成棕色沉淀，催化邻苯二胺(OPD)生成橘红色产物，催化活性依赖于pH值、温度和过氧化氢浓度，其催化机理符合乒乓机制。同时还发现磁性纳米颗粒的催化活性随着颗粒粒径的减小而增强，颗粒的粒径越小，其催化活性越高。磁性颗粒的粒径达微米量级后，催化活性降低至接近零值。与蛋白酶相比，磁性纳米颗粒具有更多的优势：(1)蛋白酶在极端pH和温度下容易变性，同时也容易被蛋白酶降解，而磁性纳米颗粒在极端条件下很稳定；(2)蛋白酶的生产成本很高，而磁性纳米颗粒制备简单、廉价；(3)由于磁性纳米颗粒具有超顺磁性，用磁铁可以回收反复利用；同时基于磁性纳米颗粒的磁可控性，拓展了其作为模拟酶的应用领域。传统的分离技术主要包括沉淀、离心等过程，这些纯化方法的步骤繁杂、费时长、收率低，接触有毒试剂，很难实现自动化操作。而磁分离技术具有快速、简便的特点，能够高效、可靠地捕获特定的蛋白质或其它生物大分子。基于磁性纳米颗粒的超顺磁性，在外加磁场下纳米颗粒被磁化，然而一旦去掉磁场，它们将立即重新分散于溶液中，通常磁分离技术主要包括以下两个步骤：(1)将要研究的生物实体标记于磁性颗粒上；(2)利用磁性分离设备将被标记的生物实体分离出来。目前，磁分离方法已经拓展到对细胞、蛋白质和核酸(DNA，RNA)等多种生物的分离和纯化。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种新颖的夹心免疫检测技术检测生物分子的方法，该方法集磁性纳米颗粒过氧化物酶催化活性及磁分离特性于一体，可以省略传统ELISA方法中引入辣根过氧化物酶标记抗体的步骤，基于此新技术的生物样本检测，简便快速。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，包括如下步骤：(1)将第一单克隆抗体偶联于第一磁性纳米酶颗粒上，获得捕获探针；(2)将第二单克隆抗体偶联于第二磁性纳米酶颗粒上，获得检测探针；(3)将待测样品与捕获探针温育；(4)第一次分离：从步骤(3)的溶液中得到捕获探针-抗原复合物；(5)重悬捕获探针-抗原复合物，加入检测探针，温育；(6)第二次分离：从溶液步骤(5)的溶液中得到捕获探针-抗原-检测探针复合物；(7)加入过氧化物和催化底物显色，通过酶联仪检测溶液的光吸收值；(8)按照步骤(1)至步骤(7)中的方法，测量已知浓度的生物分子，绘制标准曲线，从而获得待测生物样品中的抗原含量。上述纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体为待测生物样品中抗原的不同单克隆抗体。上述纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，所述第一磁性纳米酶颗粒和所述第二磁性纳米酶颗粒为尺寸大小不同的磁性纳米酶颗粒。上述纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，所述第一磁性纳米酶颗粒的粒径为0.1微米～100微米；所述第二磁性纳米酶颗粒的粒径为1纳米～100纳米。上述纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，在所述第一磁性纳米酶颗粒表面修饰二氧化硅或葡聚糖，以封闭其过氧化物酶活性；所述第二磁性纳米酶颗粒为裸露的磁颗粒或蛋白外壳包被的磁颗粒，所述蛋白外壳为病毒外壳或铁蛋白外壳。上述纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，所述第一磁性纳米酶颗粒和所述第二磁性纳米酶颗粒均为四氧化三铁颗粒；所述第一磁性纳米酶颗粒和所述第二磁性纳米酶颗粒都是球形、棒形、立方形、三角形和多角形中的一种或多种；所述第一次分离和所述第二次分离的方法为离心分离或磁场分离；步骤(3)和步骤(5)中的温育时间均为20-40min。上述纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，所述磁场分离是通过调节磁场强度进行分离的，利用电磁体或不同磁场强度的永磁体来调节磁场强度。上述纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，步骤(5)中所述过氧化物为过氧化氢和过氧化脲的一种或两种；所述催化底物为四甲基联苯胺TMB、四甲基联苯胺硫酸盐TMBS、邻苯二胺OPD、二氨基联苯胺DAB、二氨基联苯胺四盐酸DAB-4HCl、5-氨基水杨酸5-AS、邻联甲苯胺OT和连氮二铵盐ABTS中的一种或多种。上述纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，所述生物分子为蓖麻毒素，具体检测方法如下：(1)采用EDC-NHS活化羧基法将蓖麻毒素的单克隆抗体6A6偶联于粒径为1微米的二氧化硅包埋式四氧化三铁磁性颗粒，制成捕获探针；偶联的具体步骤如下：称取1mg二氧化硅修饰的粒径为1微米的四氧化三铁磁性颗粒，加入浓度为50mg/mL的N-羟基丁二酰亚胺NHS溶液和浓度为50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液各50μL，室温孵育30分钟，用去离子水清洗，除去多余的NHS/EDC；加入1mL、pH为6.0、浓度为50mmol/L的乙酸钠溶液，并加入100μg的抗蓖麻毒素单克隆抗体6A6，混匀，4℃孵育2小时，用pH为7.0、浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS洗涤，再加入浓度为50mmol/L、pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷Tris-Cl封闭活化的羧基，用pH为7.0、浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS重悬，4℃保存；偶联效果采用点印迹方法(Dotblot)检测；(2)采用EDC-NHS活化羧基法将蓖麻毒素将单克隆抗体7G7偶联于粒径为30纳米的四氧化三铁磁性颗粒上，获得检测探针；偶联的具体的步骤如下：称取1mg粒径为30纳米的四氧化三铁磁性颗粒，加入浓度为50mg/mL的N-羟基丁二酰亚胺NHS和浓度为50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC各50μL，室温孵育30分钟，用去离子水清洗，除去多余的NHS/EDC；加入1mL、pH为6.0、浓度为50mmol/L的乙酸钠溶液，并加入100μg的抗蓖麻毒素单克隆抗体7G7，混匀，4℃孵育2小时，用pH为7.0、浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS洗涤，再加入浓度为50mmol/L、pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷Tris-Cl封闭活化的羧基，用pH为7.0、浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液PBS重悬，4℃保存；偶联效果采用点印迹方法(Do本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将第一单克隆抗体偶联于第一磁性纳米酶颗粒上，获得捕获探针；(2)将第二单克隆抗体偶联于第二磁性纳米酶颗粒上，获得检测探针；(3)将待测样品与捕获探针温育；(4)第一次分离：从步骤(3)的溶液中得到捕获探针‑抗原复合物；(5)重悬捕获探针‑抗原复合物，加入检测探针，温育；(6)第二次分离：从溶液步骤(5)的溶液中得到捕获探针‑抗原‑检测探针复合物；(7)加入过氧化物和催化底物显色，通过酶联仪检测溶液的光吸收值；(8)按照步骤(1)至步骤(7)中的方法，测量已知浓度的生物分子，绘制标准曲线，从而获得待测生物样品中的抗原含量。

【技术特征摘要】
1.纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将第一单克隆抗体偶联于第一磁性纳米酶颗粒上，获得捕获探针；(2)将第二单克隆抗体偶联于第二磁性纳米酶颗粒上，获得检测探针；(3)将待测样品与捕获探针温育；(4)第一次分离：从步骤(3)的溶液中得到捕获探针-抗原复合物；(5)重悬捕获探针-抗原复合物，加入检测探针，温育；(6)第二次分离：从溶液步骤(5)的溶液中得到捕获探针-抗原-检测探针复合物；(7)加入过氧化物和催化底物显色，通过酶联仪检测溶液的光吸收值；(8)按照步骤(1)至步骤(7)中的方法，测量已知浓度的生物分子，绘制标准曲线，从而获得待测生物样品中的抗原含量。2.根据权利要求1所述的纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，其特征在于，所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体为待测生物样品中抗原的不同单克隆抗体。3.根据权利要求1所述的纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，其特征在于，所述第一磁性纳米酶颗粒和所述第二磁性纳米酶颗粒为尺寸大小不同的磁性纳米酶颗粒。4.根据权利要求3所述的纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，其特征在于，所述第一磁性纳米酶颗粒的粒径为0.1微米～100微米；所述第二磁性纳米酶颗粒的粒径为1纳米～100纳米。5.根据权利要求1所述的纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，其特征在于，在所述第一磁性纳米酶颗粒表面修饰二氧化硅或葡聚糖，以封闭其过氧化物酶活性；所述第二磁性纳米酶颗粒为裸露的磁颗粒或蛋白外壳包被的磁颗粒，所述蛋白外壳为病毒外壳或铁蛋白外壳。6.根据权利要求1所述的纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，其特征在于，所述第一磁性纳米酶颗粒和所述第二磁性纳米酶颗粒均为四氧化三铁颗粒；所述第一磁性纳米酶颗粒和所述第二磁性纳米酶颗粒都是球形、棒形、立方形、三角形和多角形中的一种或多种；所述第一次分离和所述第二次分离的方法为离心分离或磁场分离；步骤(3)和步骤(5)中的温育时间均为20-40min。7.根据权利要求6所述的纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，其特征在于，所述磁场分离是通过调节磁场强度进行分离的，利用电磁体或不同磁场强度的永磁体来调节磁场强度。8.根据权利要求1所述的纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，其特征在于，步骤(5)中所述过氧化物为过氧化氢和过氧化脲的一种或两种；所述催化底物为四甲基联苯胺、四甲基联苯胺硫酸盐、邻苯二胺、二氨基联苯胺、二氨基联苯胺四盐酸、5-氨基水杨酸、邻联甲苯胺和连氮二铵盐中的一种或多种。9.根据权利要求1所述的纳米酶免疫夹心新技术检测生物分子的方法，其特征在于，所述生物分子为蓖麻毒素，具体检测方法如下：(1)采用EDC-NHS活化羧基法将蓖麻毒素的单克隆抗体6A6偶联于粒径为1微米的二氧化硅包埋式四氧化三铁磁性颗粒，制成捕获探针；其中：EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS为N-羟基丁二酰亚胺；偶联的具体步骤如下：称取1mg二氧化硅修饰的粒径为1微米的四氧化三铁磁性颗粒，加入浓度为50mg/mL的N-羟基丁二酰亚胺溶液和浓度为50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液各50μL，室温孵育30分钟，用去离子水清洗，除去多余的NHS/EDC；加入1mL、pH为6.0、浓度为50mmol/L的乙酸钠溶液，并加入100μg的抗蓖麻毒素单克隆抗体6A6，混匀，4℃孵育2小时，用pH为7.0、浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤，再加入浓度为50mmol/L、pH为7.4的三羟甲基氨基甲烷封闭活化的羧基，用pH为7.0、浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液重悬，4℃保存；偶联效果采用点印迹方法检测；(2)采用EDC-NHS活化羧基法将蓖麻毒素将单克隆抗体7G7偶联于粒径为30纳米的四氧化三铁磁性颗粒上，获得检测探针；其中：EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS为N-羟基丁二酰亚胺；偶联的具体的步骤如下：称取1mg粒径为30纳米的四氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜鸿雁，段德民，宋歌，阎锡蕴，丰蕾，董颖，魏春明，高艳梅，于忠山，
申请(专利权)人：公安部物证鉴定中心，中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11