一种核酸适体生物传感器及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种核酸适体生物传感器及在检测内毒素中的应用，所述传感器以金电极为基底，在基底表面自组装3～巯基丙酸，然后再在3～巯基丙酸上偶联氨基修饰的核酸适体。本发明专利技术有益效果主要体现在：本发明专利技术构建的核酸适体生物传感器用于细菌内毒素检测，构建简易，特异性高，检测限低，灵敏度达0.001EU/mL。所述细菌内毒素核酸适体生物传感器具有制备方便简单，易于操作，灵敏度高，检测限低等特点，可以进一步提高生物传感器的稳定性，进而使其具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸适体生物传感器及其制备与应用(一)
本专利技术涉及一种核酸适体内毒素电化学生物传感器的制备，属于生物
，特别是生物传感器领域。(二)
技术介绍
细菌内毒素在1892-1895年由RichardPfeiffer从热灭活的霍乱弧菌(Vihriocholerae)溶解物中发现。内毒素的主要成分是脂多糖(LPS)，脂多糖又包括菌体多糖、核心多糖和类脂A(LipidA)。类脂A是内毒素的主要活性成分，一种特殊的糖磷脂，是一种强免疫刺激因子，进入机体后作用于巨噬细胞，促使巨噬细胞产生多种细胞因子，引起发热，并造成心跳过速、休克、多器官功能衰竭等并发症甚至死亡。对机体的致热效应在临床上最为常见，内毒素致热非常敏感，作为外源性致热源，可引起内源性发热，同时它又可激活单核细胞，释放单核细胞因子形成内源性致热源，引起机体发热，中国药典对内毒素限量有着非常严格的规定，其中鞘内注射剂为0.2EU，放射性药品注射剂为2.5EU，每单位体重注射剂为5EU。因此检测和分离非肠道用药品尤其是注射针剂中的细菌内毒素成了生产工艺中的重要环节。近年来国内外报道革兰阴性菌感染有逐年增长的趋势，而内毒素作为革兰阴性菌的细胞壁结构成分，可使机体出现许多病理情况，因此建立一种能够对内毒素特异、灵敏的检测手段非常必要。上世纪90年代末期我国对生物传感器的研究开始发展，解决了材料的固定化技术、信号处理的电子技术，研发了一系列反应精确的分子装置，为生物传感器技术奠定了良好的技术基础。随着核酸适体作为生物传感器的敏感元件的优势越来越明显，基于核酸适体的生物传感器也成为国内外的研究热点。生物传感器所建立的分析方法主要包括两个大类，即光学检测和电化学检测。其中电化学分析技术作为一种灵敏度高、所需药品少、操作简单、便携和能在体检测等优点的检测手段，已经非常广泛的应用于生物传感器中，将其与核酸适体相结合构建新一代核酸适体电化学传感器，已成为分析与生命学科交叉研究的重要研究领域之一。基于核酸适体的电化学生物传感器结合了适配体与电化学分析两方面的优点，能将微小环境的变化转化为可测的电信号，对细菌内毒素进行定性定量分析，弥补了当前内毒素检测操作复杂、耗时长、检测范围窄等缺陷。本专利技术选择金电极表面作为生物传感器的基底层，以3-巯基丙酸(3-Mercaptopropionicacid，简称MPA)为中间连接物，将氨基修饰的核酸适体固定到金电极表面，制备了一种核酸适体电化学生物传感器用于细菌内毒素的检测。(三)
技术实现思路
本专利技术涉及一种核酸适体内毒素电化学生物传感器的制备，具有灵敏度高、检测限低、易于操作等优点。本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供一种核酸适体生物传感器，所述传感器以金电极为基底，在基底表面自组装3～巯基丙酸，然后再在3～巯基丙酸上偶联氨基修饰的核酸适体。进一步，所述金电极先经过清洗处理再用作基底，所述清洗方法为：将金电极依次采用粒径为1.00μm、0.30μm和0.05μm氧化铝粉打磨抛光，用二次去离子水将金电极表面清洗干净后，再分别用无水乙醇和二次去离子水将电极超声(40KHz)清洗两次，每次5min；将二次去离子水超声后的金电极吹干后置于0.2-0.5M的H2SO4水溶液中，在电压0-1.6V、扫描速度100mV/s的条件下进行循环伏安扫描，直到循环伏安曲线稳定，取出金电极用二次去离子水冲洗去掉电极上残留的H2SO4，吹干后，获得清洗后的金电极。进一步，所述H2SO4水溶液浓度为0.5M。进一步，所述3～巯基丙酸自组装方法为：将金电极置于100～200mM的3-巯基丙酸乙醇溶液中，室温下避光孵育6～8h，用无水乙醇清洗金电极表面未结合的3-巯基丙酸，氮气吹干，获得3-巯基丙酸修饰的金电极。进一步，所述氨基修饰的核酸适体偶联方法为：将表面自组装3～巯基丙酸的基底置于偶联反应体系中，在室温下反应40～60min，用二次去离子水将未结合的氨基修饰的核酸适体洗去，获得核酸适体电化学生物传感器；所述偶联反应体系组成为：20mM吗啉乙磺酸、20mM1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、20mMN-羟基丁二酰亚胺(MES-EDC/NHS)和100～200nM氨基修饰的核酸适体，溶剂为结合缓冲液；所述结合缓冲液组成为：NaCl120mM，KCl5mM，MgCl21mM，CaCl21mM，Tris50mM，pH7.4。进一步，所述所述氨基修饰的核酸适体中核酸适体为核酸适体EAQ3，核苷酸序列为：NH2-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATCGCCGCGCTGGCCGATCGTTCCTCCCCCCCCGTGTGTAGGAGGGTGCGAAGTA。本专利技术还提供一种核酸适体生物传感器的制备方法，所述方法为：(1)将金电极依次采用粒径为1.00μm、0.30μm和0.05μm氧化铝粉打磨抛光，用二次去离子水将金电极表面清洗干净后，再分别用无水乙醇和二次去离子水将电极超声(40KHz)清洗两次，每次5min；将二次去离子水超声后的金电极吹干后置于0.2-0.5M的H2SO4水溶液中，在电压0-1.6V、扫描速度100mV/s的条件下进行循环伏安扫描，直到循环伏安曲线稳定，取出金电极用二次去离子水冲洗电极上残留的H2SO4，吹干，获得清洗后的金电极；(2)将清洗后的金电极置于100～200mM的3-巯基丙酸乙醇溶液中，室温下避光孵育6～8h，用无水乙醇清洗金电极表面未结合的3-巯基丙酸，吹干，获得3-巯基丙酸修饰的金电极；(3)将表面自组装3～巯基丙酸的基底置于偶联体系中，室温下反应40～60min，用二次去离子水将未结合的氨基修饰的核酸适体洗去，获得核酸适体电化学生物传感器；所述偶联反应体系组成为：20mM吗啉乙磺酸、20mM1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、20mMN-羟基丁二酰亚胺(MES-EDC/NHS)和100～200nM氨基修饰的核酸适体，溶剂为结合缓冲液；所述结合缓冲液组成为：NaCl120mM，KCl5mM，MgCl21mM，CaCl21mM，Tris50mM，pH7.4。此外，本专利技术还提供一种所述核酸适体生物传感器在检测内毒素中的应用，具体所述应用方法为：将核酸适体生物传感器置于待测样品中，室温下反应40-60min，用洗涤缓冲液洗去未结合的内毒素后，然后置于电解液中，在0.1Hz～100kHz、振幅为1-5mV条件下进行电化学阻抗谱表征，获得待测样品阻抗差值；根据内毒素标准曲线，进而获得待测样品中内毒素含量；所述内毒素标准曲线是在待测样品检测相同条件下，以内毒素浓度对数值为横坐标，以阻抗差值为纵坐标制成；所述电解液是含2～10mMK3Fe(CN)6、2～10mMK4Fe(CN)6·3H2O的pH7.4的PBS缓冲液；所述洗涤缓冲液是含体积浓度0.05％Tween20的pH7.4的PBS缓冲液；所述PBS缓冲液组成为：NaCl137mM、Na2HPO48mM、K2HPO41.2mM，KCl2.7mM，溶剂为水，pH7.4。进一步，所述内毒素标准曲线按如下方法制备：将核酸适体生物传感器分别浸入10-3EU/mL、10-2EU/mL、10-1EU/mL和1EU/mL的细菌内毒素水溶液(溶剂是内毒素检测用水)中，室本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸适体生物传感器，其特征在于所述传感器以金电极为基底，在基底表面自组装3～巯基丙酸，然后再在3～巯基丙酸上偶联氨基修饰的核酸适体。

【技术特征摘要】
1.一种核酸适体生物传感器，其特征在于所述传感器以金电极为基底，在基底表面自组装3～巯基丙酸，然后再在3～巯基丙酸上偶联氨基修饰的核酸适体。2.如权利要求1所述核酸适体生物传感器，其特征在于所述金电极先经过清洗处理再用于基底，所述清洗方法为：将金电极依次采用粒径为1.00μm、0.30μm和0.05μm氧化铝粉打磨抛光，用二次去离子水将金电极表面清洗干净后，再分别用无水乙醇和二次去离子水将金电极超声清洗两次，每次5min；将二次去离子水超声后的金电极吹干后置于0.2-0.5M的H2SO4水溶液中，在电压0-1.6V、扫描速度100mV/s的条件下进行循环伏安扫描，直到循环伏安曲线稳定，取出金电极用二次去离子水冲洗去掉电极上残留的H2SO4，吹干后，获得清洗后的金电极。3.如权利要求2所述核酸适体生物传感器，其特征在于所述H2SO4水溶液浓度为0.5M。4.如权利要求1所述核酸适体生物传感器，其特征在于所述3～巯基丙酸自组装方法为：将金电极置于100～200mM的3-巯基丙酸乙醇溶液中，室温下避光孵育6～8h，用无水乙醇清洗金电极表面未结合的3-巯基丙酸，吹干，获得3-巯基丙酸修饰的金电极。5.如权利要求1所述核酸适体生物传感器，其特征在于所述氨基修饰的核酸适体偶联方法为：将表面自组装3～巯基丙酸的基底置于偶联反应体系中，室温下反应40～60min，用二次去离子水将未结合的氨基修饰的核酸适体洗去，获得核酸适体电化学生物传感器；所述偶联反应体系组成为：20mM吗啉乙磺酸、20mM1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、20mMN-羟基丁二酰亚胺和100～200nM氨基修饰的核酸适体，溶剂为结合缓冲液；所述结合缓冲液组成为：NaCl120mM，KCl5mM，MgCl21mM，CaCl21mM，Tris50mM，pH7.4。6.如权利要求5所述核酸适体生物传感器，其特征在于所述所述氨基修饰的核酸适体中核酸适体核苷酸序列为：ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATCGCCGCGCTGGCCGATCGTTCCTCCCCCCCCGTGTGTAGGAGGGTGCGAAGTA。7.一种权利要求1核酸适体生物传感器的制备方法，其特征在于所述方法为：(1)将金电极依次采用粒径1.00μm、0.30μm和0.05μm氧化铝粉打磨抛光，用二次去离子水将金电极表面清洗干净后，再分别用无水乙醇和二次去离子水将电极超声清洗两次，每次5min；将二次去离子水超声后的金电极吹干后置于0.2-0.5M的H2SO4...

【专利技术属性】
技术研发人员：应国清，易喻，王敏君，梅建凤，陈建澍，张彦璐，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33