一种探针法数字定量PCR试剂盒及其应用和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种探针法数字定量PCR试剂盒及其应用和使用方法。公开了环状RNA hsa_circ_051778为检测指标在探针法数字定量PCR试剂盒中的应用，通过检测胸水外泌体样本中环状RNA hsa_circ_051778拷贝数作为检测指标。所述试剂盒包括环状RNA hsa_circ_051778特异性引物、环状RNA hsa_circ_051778特异性探针、肺腺癌患者胸水外泌体RNA逆转录后所得到的cDNA、探针法数字PCR专用PCR扩增预混液即2x ddPCR Supermix for Probes和无菌去离子水。使用本发明专利技术所述检测工具对肺腺癌和结核性胸膜炎进行鉴别，检测结果表明：该检测工具的灵敏度可达90%以上左右，高于目前临床使用的单一方法。

【技术实现步骤摘要】
一种探针法数字定量PCR试剂盒及其应用和使用方法
本专利技术涉及试剂盒及其应用，尤其涉及一种探针法数字定量PCR试剂盒及其应用和使用方法。
技术介绍
肺腺癌和结核性胸膜炎是临床常见的呼吸系统疾病，两种疾病的一些临床表现较为相似，但是其治疗方案和预后却有明显的不同，因此准确地诊断这两种疾病对于患者的预后极为重要。胸腔积液即胸水，是指机体受到某些疾病影响胸膜后导致的胸腔液体异常增多。肺腺癌和结核性胸膜炎是引发胸水的常见病因，可通过检测胸水中的结核杆菌或者肿瘤细胞来确诊，但是在实际临床工作中阳性检测率较低，因此临床上还将通过病史、血液检测、胸水生化检测、血沉检测、结核抗体检测、细胞染色体检测、肿瘤抗原检测等等对两者进行鉴别诊断，鉴别过程较为繁琐，耗时，也增加了患者的经济负担。
技术实现思路
本专利技术旨在解决现有技术中肺腺癌和结核性胸膜炎难以鉴别的问题，提出了探针法数字定量PCR试剂盒及其应用，该试剂盒能够快速地对肺腺癌和结核性胸膜进行鉴别，同时检测准确率高。为了实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：环状RNAhsa_circ_051778作为检测指标在探针法数字定量PCR试剂盒中的应用。一种如上所述的探针法数字定量PCR试剂盒，所述试剂盒通过检测胸水外泌体样本中环状RNAhsa_circ_051778的拷贝数作为检测指标。进一步地,本专利技术所述试剂盒包括环状RNAhsa_circ_051778特异性引物、环状RNAhsa_circ_051778特异性探针、肺腺癌患者胸水外泌体RNA逆转录后所得到的cDNA、探针法数字PCR专用PCR扩增预混液和无菌去离子水。所述探针法数字PCR专用PCR扩增预混液为2xddPCRSupermixforProbes。进一步地,本专利技术所述环状RNAhsa_circ_051778特异性引物包括前引物和后引物；所述前引物序列为：5’-GAAATAAAATGCCAAAGAACACACA-3’；所述后引物序列为5’-TGGGCAGAGAATGACGAACAG-3’。进一步地,本专利技术所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针的序列为：5’-TGTCAGCCAGCCCAC-3’。进一步地,本专利技术所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针序列5’端标记FAM荧光报告基团、VIC荧光报告基团或HEX荧光报告基团；所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针序列3’端标记MinorGrooveBinder和Quencher荧光淬灭基团。进一步地,本专利技术所述的探针法数字定量PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：A.取样取患者1µg的胸水外泌体RNA逆转录得到cDNA；B.PCR扩增体系配制将步骤A中的cDNA加入以下物质形成扩增体系：2xddPCRSupermixforProbes10µL；环状RNAhsa_circ_051778特异性引物的前引物和后引物，其终浓度各为900nM；环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针，其终浓度为250nM；C.扩增反应将步骤B的扩增体系在以下条件下进行扩增反应得到环状RNAhsa_circ_051778：95℃10分钟激活酶活性；94℃变性30秒，60℃退火/延伸1分钟，共40个循环；98℃10分钟灭活酶活性；D.拷贝数测定采用探针法对步骤C所得扩增产物进行定量检测，得环状RNAhsa_circ_0051778拷贝数；E.鉴别将步骤D中的环状RNA拷贝数与参考值（3.4拷贝/孔）进行比较；若前者大于后者,则判断该患者为结核性胸膜炎患者；反之该患者为肺腺癌患者。进一步地,本专利技术所述的探针法数字定量PCR试剂盒的使用方法，所述步骤A中的RNA的纯度为：A260/A280=1.4～2.1。进一步地,本专利技术所述的探针法数字定量PCR试剂盒的使用方法，所述步骤A中RNA逆转录采用随机六聚体引物。本专利技术的有益效果：（一）本专利技术为快速鉴别肺腺癌和结核性胸膜炎提供了一种新检测指标的新型检测工具。（二）使用本专利技术所述检测工具对肺腺癌和结核性胸膜炎进行鉴别，检测结果表明：该检测工具的灵敏度可达90%以上左右，远远高于目前临床使用的单一方法。（三）本专利技术提供的检测工具检测效率较高，仅需6小时即可判断96个待测样本的来源，大大提高了诊疗效率。（四）本专利技术提供的检测试剂盒成本较低，每个样本仅需100元左右，极大的降低了患者的费用。（五）本专利技术提供的检测工具通过拷贝数即可直接判断待测样本的来源，结果判断较容易，不需要专业培训。附图说明图1为RNA纯度与准确度关系示意图。图2为采用本专利技术所述试剂盒诊断10个病例的结果与最终诊断结果对比。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步地详细说明，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1以环状RNAhsa_circ_051778作为检测指标在探针法数字定量PCR试剂盒中的应用，所述试剂盒通过检测胸水外泌体样本中环状RNAhsa_circ_051778拷贝数作为指标。上述的以环状RNAhsa_circ_051778作为检测指标在探针法数字定量PCR试剂盒，包括环状RNAhsa_circ_051778特异性引物、环状RNAhsa_circ_051778特异性探针、肺腺癌患者胸水外泌体RNA逆转录后所得到的cDNA和无菌去离子水。本实施例中，所述环状RNAhsa_circ_051778特异性引物包括前引物和后引物；所述前引物序列为：5’-GAAATAAAATGCCAAAGAACACACA-3’；所述后引物序列为5’-TGGGCAGAGAATGACGAACAG-3’。本实施例中，所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针的序列为：5’-TGTCAGCCAGCCCAC-3’。本实施例中，所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针序列5’端标记FAM荧光报告基团；所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针序列3’端标记MinorGrooveBinder荧光淬灭基团。实施例2本实施例与实施例1的区别在于：所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针序列5’端标记FAM荧光报告基团Quencher荧光淬灭基团。实施例3本实施例与实施例2的区别在于：所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针序列5’端标记VIC荧光报告基团；所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针序列3’端标记MinorGrooveBinder荧光淬灭基团。实施例4本实施例与实施例2的区别在于：所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针序列5’端标记VIC荧光报告基团；所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针序列3’端标记Quencher荧光淬灭基团。实施例5本实施例与实施例2的区别在于：所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针序列5’端标记HEX荧光报告基团；所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针序列3’端标记MinorGrooveBinder荧光淬灭基团。实施例6本实施例与实施例2的区别在于：所述环状RNAhsa_circ_051778特异性M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.环状RNA hsa_circ_051778作为检测指标在探针法数字定量PCR试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.环状RNAhsa_circ_051778作为检测指标在探针法数字定量PCR试剂盒中的应用。2.一种如权利要求1所述的探针法数字定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过检测胸水外泌体样本中环状RNAhsa_circ_051778拷贝数作为检测指标；若胸水外泌体样本中环状RNAhsa_circ_051778拷贝数大于3.4,则判断该患者为结核性胸膜炎患者;反之该患者为肺腺癌患者。3.根据权利要求2所述的探针法数字定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括环状RNAhsa_circ_051778特异性引物、环状RNAhsa_circ_051778特异性探针、肺腺癌患者胸水外泌体RNA逆转录后所得到的cDNA、探针法数字PCR专用PCR扩增预混液和无菌去离子水。4.根据权利要求3所述的探针法数字定量PCR试剂盒，其特征在于：所述环状RNAhsa_circ_0517788特异性引物包括前引物和后引物；所述前引物序列为：5’-GAAATAAAATGCCAAAGAACACACA-3’；所述后引物序列为5’-TGGGCAGAGAATGACGAACAG-3’。5.根据权利要求3所述的探针法数字定量PCR试剂盒，其特征在于：所述环状RNAhsa_circ_051778特异性MGB探针的序列为：5’-TGTCAGCCAGCCCAC-3’。6.根据权利要求5所述的探针法数字定量PCR试剂盒，其特征在于：所述环状RNAhsacirc0051778特异性MGB探针序列5’端标记FAM荧光报告基团、VIC荧光报告基团或HE...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳云，农雪萍，张林，黄建华，车光璐，罗海玻，周斌，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：四川,51