一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法及所用的地高辛标记DNA探针技术

本发明专利技术涉及海洋生物技术领域，尤其涉及一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法及其所用的地高辛标记DNA探针，该方法使用的探针是与待测DNA碱基互补的248个碱基长度的单链DNA，探针3′端被地高辛标记。通过菌落原位斑点分子杂交，该探针可特异性检测待测菌株DNA样品中有否有膝沟藻毒素合成(sxtS)基因核酸的存在，筛选出产毒阳性菌株。本发明专利技术涉及的方法利用菌株DNA原位提取物进行菌落斑点杂交，可在8‑10小时内完成96个样品筛选。本发明专利技术的方法快速，特异性强且准确性高。

【技术实现步骤摘要】
一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法及所用的地高辛标记DNA探针
本专利技术涉及海洋生物
，尤其涉及一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法及其所用的地高辛标记DNA探针。
技术介绍
膝沟藻毒素(gonyautoxins，GTXs)是麻痹性贝类毒素中的一种，属胍胺类神经毒素，是特异性钠离子通道阻断剂。GTXs在有害赤潮检测、神经生理学、医学诊断、药物开发、生化战剂等研究中均有重要应用。在医学诊断与药物开发方面，因其独特的化学结构和毒理作用机制，成为研究细胞Na+通道的一种重要工具药。且具有高效的镇痛、麻醉、解痉、降压、止喘等多种功效，是海洋新药开发的重要先导化合物。部分海洋甲藻、淡水蓝藻及海洋微生物均可产生GTXs。目前，GTXs主要通过海洋赤潮甲藻如微小亚历山大藻的培养及产物提取制备获得。该方法不仅培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备。海洋细菌是产GTXs的另一个来源。其具有具有易培养、代谢调控相对简单等特性，因此，利用产毒海洋细菌发酵制备GTXs，是一条行之有效的方法。其关键是产毒菌株的快速筛选。其可通过代谢产物化学分析来实现，不仅工作量大、周期长，且化学分析所用毒素标准品价格昂贵、分析成本高。而目前尚无产膝沟藻毒素菌株的快速筛选技术。CHENTaoYing,LIUJunXiu,LIShuiJun,等.GONYAUTOXIN:HPLC-MSDETECTIONANDACCUMULATIONINMARINEORGANISMS膝沟藻毒素液质联用快速检测及其在海洋生物体内的累积[J].海洋与湖沼,2009,40(1):88-93.一文中采用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)分析了亚历山大藻和蒙古裸腹溞等微生物中的积累量，并且通过饲喂的方式对其调控积累量以及积累效率的影响因素进行筛选，但通过该文仅能提高现有的、已知的能够产生GTXs的微生物、菌株等进行加快其产生和积累，而无法从大量混杂的微生物、菌株等中迅速筛选出能够产生膝沟藻毒素的菌株。
技术实现思路
为解决目前无法对能够产生膝沟藻毒素(GTXs)的菌株进行快速筛选，仅可通过代谢产物化学分析来实现，不仅工作量大、周期长，且化学分析所用毒素标准品价格昂贵、分析成本高等问题，本专利技术提供了一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，通过探针标记能够快速对大量混杂的菌株进行筛分。本专利技术的另一目的是提供一种用于上述方法进行筛选的地高辛标记DNA探针。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，所述方法包括以下步骤：1)取待检测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜制成待检膜，对待检膜进行预处理得到预处理DNA膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在40～45℃条件下培育40～50min，得到预杂交液；2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理8～12min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：(1.2～1.8)，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于40～45℃下作用45～60min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤1～3次，每次3～7min，得到三次处理DNA膜4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗30～90s，弃去缓冲液再加入1～3％VOL的封闭液，室温放置40～70min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于35～39℃条件下温育20～30min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗2～6次，随后置于显色缓冲液中平衡90～150s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；5)将步骤5)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生膝沟藻毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性。本专利技术方法首先通过将对待检测菌株进行落点培育形成待检膜，并对其进行适当的杂交和DNA标记，并在DNA标记后加入地非放射性的高辛标记DNA探针，利用基因探针仅标记，若发生结合即可在结合部位获得可识别信号，所述地高辛标记DNA探针对能够产生膝沟藻毒素的菌株进行标记，而通常在标记后续进行复杂的检测才能检测到探针的可识别信号，但在本方法中在地高辛标记DNA探针进行标记后，可通过封闭和多次清洗，去除杂质后通过显色缓冲液和显色液进行显色反应，再通过TE缓冲液终止反应，随后即可对DNA膜利用普通光学显微镜甚至可直接使用肉眼进行快速观察，实现快速高效筛选菌株的目的。作为优选，所述预处理步骤包括将待检膜浸于0.3～0.8mol/L的NaOH溶液中5～15min，浸渍后置于60～90℃条件下干燥1～2h以固定DNA，再将其置于3～8mg/mL、pH为7.6～8.3的溶菌酶溶液中，在35～39℃条件下温水浴15～30min，以TE缓冲液冲去膜表面细菌细胞残留物。作为优选，步骤1)和步骤3)所述杂交液为在2×SSC溶液中加入45～55mmol/L的磷酸缓冲液和0.8～1.2mmol/L的EDTA，并含有7.5～12.5wt％硫酸葡聚糖和45～55wt％去离子甲酰胺的混合液，杂交液pH值为6.8～7.2。作为优选，步骤4)所述缓冲液中含有0.08～0.115mol/L的顺丁烯二酸和0.115～0.165mol/L的NaCl，缓冲液pH值为7.4～7.6。作为优选，步骤4)所述封闭液中含有0.08～0.115mol/L的Tris-HCl、0.13～0.165mol/L的NaCl和0.085～0.125mol/L的MgCl2，封闭液pH值为7.8～8.1。作为优选，步骤4)所述冲洗液中含有0.08～0.115mol/L的Tris-HCl和0.13～0.165mol/L的NaCl，冲洗液pH值为7.3～7.7。作为优选，步骤4)所述显色缓冲液中含有0.08～0.125mol/L的Tris、0.085～0.11mol/L的NaCl和40～55mmol/L的MgCl2，显色缓冲液pH值为9.4～9.6。作为优选，步骤4)所述显色液中含有0.225～0.35mg/mL的NBT和0.125～0.195mg/mL的BCIP，显色液pH值为8.8～9.3。一种地高辛标记DNA探针，所述地高辛标记DNA探针为SEQIDNO.1：5'-CCTCCTTAGCCTCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGCACCTCCTTACGTCACTTAGCCCTCCTGCTGTCGACCTCCTACGAATATCGATCCGAGGCCTCCTACGCCGGCTAGGCCTTCGCCGACTCCTCCTCCCTCCTGGCGCCCTCCTGCCTCCTGGCGGCACGTGACTCTCAACGCACGCTCCTCCCTCCTCTGAACGTCGGCAGGACCCTTAGGCAGCAGCACCTAGGCTCCGCCTTGTGCAAGTCC-3'。利用探针标记的方式相比于普通的常用的对菌株产生的代谢产物进行化学分析的方法，其避免了代谢产物中的杂质带来的检测误差，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)取待检测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜制成待检膜，对待检膜进行预处理得到预处理DNA膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在40～45℃条件下培育40～50min，得到预杂交液；2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理8～12min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：(1.2～1.8)，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于40～45℃下作用45～60min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤1～3次，每次3～7min，得到三次处理DNA膜4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗30～90s，弃去缓冲液再加入1～3％VOL的封闭液，室温放置40～70min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于35～39℃条件下温育20～30min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗2～6次，随后置于显色缓冲液中平衡90～150s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；5)将步骤5)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生膝沟藻毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性。...

【技术特征摘要】
1.一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)取待检测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜制成待检膜，对待检膜进行预处理得到预处理DNA膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在40～45℃条件下培育40～50min，得到预杂交液；2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理8～12min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：(1.2～1.8)，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于40～45℃下作用45～60min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤1～3次，每次3～7min，得到三次处理DNA膜4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗30～90s，弃去缓冲液再加入1～3％VOL的封闭液，室温放置40～70min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于35～39℃条件下温育20～30min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗2～6次，随后置于显色缓冲液中平衡90～150s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；5)将步骤5)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生膝沟藻毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性。2.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，所述预处理步骤包括将待检膜浸于0.3～0.8mol/L的NaOH溶液中5～15min，浸渍后置于60～90℃条件下干燥1～2h以固定DNA，再将其置于3～8mg/mL、pH为7.6～8.3的溶菌酶溶液中，在35～39℃条件下温水浴15～30min，以TE缓冲液冲去膜表面细菌细胞残留物。3.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤1)和步骤3)所述杂交液为在2×SSC溶液中加入45～55mmol/L的磷酸缓冲液和0.8～1.2mmol/L的EDTA，并含有7.5～12.5wt％硫酸葡聚糖和45～55wt％去离子甲酰胺的混合液，杂交液pH值为6.8～7.2。4.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤4)所述缓冲液中含有0.08...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓玲，杨桥，穆军，蒋志伟，张若男，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33