【技术实现步骤摘要】
一种快速筛选产生河豚毒素微生物菌株的方法及所用的地高辛标记DNA探针
本专利技术涉及海洋生物
,尤其涉及一种快速筛选产生河豚毒素微生物菌株的方法及其所用的地高辛标记DNA探针。
技术介绍
河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是河豚及其它生物体内存在的一种小分子非蛋白生物碱神经毒素。是自然界中所发现的毒性最强的神经毒素之一。其毒性比氰化物高一千多倍,可高选择性和高亲和性地阻断神经兴奋膜上钠离子通道,阻碍神经传导,从而引起神经麻痹而致死亡。TTX对头痛、关节炎、破伤风、霍乱、伤寒、哮喘、百日咳、晚期癌症等疾病均有一定疗效。河豚毒素有望被开发为首选麻醉剂与戒毒剂。作为镇痛剂,其镇痛作用是吗啡的3000倍,比普鲁卡因和可卡因强10万倍。而作为戒毒剂,由于其独特的生物学特征,用TTX戒毒的有效率达98%。TTX具有较强的局麻作用,在所用剂量未发现毒性反应,且无使用依赖性。目前,TTX的获得主要通过对有毒河豚内脏如卵巢、脾脏、肝脏、血液、精巢等提取制备而来。该方法费时、费力、成本高,且所获TTX量有限。海洋细菌是产TTX的另一个来源。其具有具有易培养、代谢调控相对简单等特性,因此,利用产毒海洋细菌发酵制备TTX,是一条行之有效的方法。其关键是产毒菌株的快速筛选。其可通过代谢产物化学分析来实现,不仅工作量大、周期长,且化学分析所用毒素标准品价格昂贵、分析成本高。而目前尚无产河豚毒素菌株的快速筛选技术。马春燕,刘松,陆豫,等.鄱阳湖野生河豚鱼体内河豚毒素产生菌的分离鉴定[J].天然产物研究与开发,2012,24(12):001766-1776.一文中通过小鼠 ...
【技术保护点】
1.一种快速筛选产生河豚毒素微生物菌株的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:1)取待检测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜制成待检膜,对待检膜进行预处理得到预处理DNA膜,将所得的预处理DNA膜置于杂交液中,在40~45℃条件下培育40~50min,得到预杂交液;2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理8~12min后置于冰浴中冷却,得到标记DNA溶液,取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液,所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5:(1.2~1.8),混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜;3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中,并加入地高辛标记DNA探针,于40~45℃下作用45~60min,随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤1~3次,每次3~7min,得到三次处理DNA膜4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗30~90s,弃去缓冲液再加入1~3%VOL的封闭液,室温放置40~70min,弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液,于35~39℃条件下温育20~30min,弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲 ...
【技术特征摘要】
1.一种快速筛选产生河豚毒素微生物菌株的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:1)取待检测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜制成待检膜,对待检膜进行预处理得到预处理DNA膜,将所得的预处理DNA膜置于杂交液中,在40~45℃条件下培育40~50min,得到预杂交液;2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理8~12min后置于冰浴中冷却,得到标记DNA溶液,取标记DNA溶液加入至步骤2)所得的预杂交液中配制混合液,所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5:(1.2~1.8),混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜;3)将步骤3)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中,并加入地高辛标记DNA探针,于40~45℃下作用45~60min,随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤1~3次,每次3~7min,得到三次处理DNA膜4)将步骤4)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗30~90s,弃去缓冲液再加入1~3%VOL的封闭液,室温放置40~70min,弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液,于35~39℃条件下温育20~30min,弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗2~6次,随后置于显色缓冲液中平衡90~150s,弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液,置于暗处至显色后加入TE缓冲液终止反应,得到终处理DNA膜;5)将步骤5)所得的终处理DNA膜进行观察,有斑点出现表示结果为阳性,即为产生河豚毒素的微生物菌株,反之无斑点出现的表示结果为阴性。2.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生河豚毒素微生物菌株的方法,其特征在于,所述预处理步骤包括将待检膜浸于0.3~0.8mol/L的NaOH溶液中5~15min,浸渍后置于60~90℃条件下干燥1~2h以固定DNA,再将其置于3~8mg/mL、pH为7.6~8.3的溶菌酶溶液中,在35~39℃条件下温水浴15~30min,以TE缓冲液冲去膜表面细菌细胞残留物。3.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生河豚毒素微生物菌株的方法,其特征在于,步骤1)和步骤3)所述杂交液为在2×SSC溶液中加入45~55mmol/L的磷酸缓冲液和0.8~1.2mmol/L的EDTA,并含有7.5~12.5wt%硫酸葡聚糖和45~55wt%去离子甲酰胺的混合液,杂交液pH值为6.8~7.2。4.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生河豚毒素微生物菌株...
【专利技术属性】
技术研发人员:杨桥,张晓玲,穆军,蒋志伟,张若男,
申请(专利权)人:浙江海洋大学,
类型:发明
国别省市:浙江,33
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