ctDNA建库试剂盒和建库方法技术

技术编号:19735155 阅读:41 留言:0更新日期:2018-12-12 03:05
本发明专利技术属于分子基因学领域,具体涉及一种ctDNA建库试剂盒和建库方法;包括发卡接头A、双链接头B和引物组;所述发卡接头A包括接头A1和接头A2,接头A1和接头A2的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2,且接头A2的3′端用生物素修饰;所述双链接头B包括接头B1和接头B2,接头B1和接头B2的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;所述引物组包括扩增引物和接头引物,扩增引物的序列号为SEQ ID NO.5,接头引物的序列为SEQ ID NO.6‑7;本发明专利技术提供的试剂盒灵敏度高,能提高ctDNA测序通量和测序准确性。

【技术实现步骤摘要】
ctDNA建库试剂盒和建库方法
本专利技术属于分子基因学领域,具体涉及一种ctDNA建库试剂盒和建库方法。
技术介绍
ctDNA,即循环肿瘤DNA,是体内循环肿瘤细胞和肿瘤组织在细胞代谢时留在血浆中的残留物。科学研究发现,利用测序技术对ctDNA进行高通量分析,即可根据基因突变信息来指导抗肿瘤药物选用、疗效评估、预后判断,甚至早期发现和早期诊断。然而,血浆中的ctDNA浓度极低,且多为小片段分子,提取困难,丢失量大,检测灵敏度低,这为测序文库的制备带来了挑战。目前市场上ctDNA建库的方法是在双链DNA末端补平加A,然后再加接头进行扩增。然而,由于ctDNA的高度片段化特点,导致部分ctDNA无法补平加接头,造成了ctDNA的损耗,使一些基因突变位点无法被检测到,限制了检测灵敏度。申请号为CN201710116455.3的专利申请,试图通过单链连接酶解连接接头决上述问题,虽然提高了一定的检测灵敏度,但是单链连接酶对单链DNA分子具有很强的环化作用,并且单链连接酶连接时对DNA单链末端存在碱基偏好性由强到弱依次为T>A>G>C,从而影响了检测灵敏度,因此仍然需要更加行之有效的方案以弥补现有技术的不足。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种高灵敏性的ctDNA建库的试剂盒。为实现上述目的,本专利技术采用的技术方案是:一种ctDNA建库试剂盒,包括发卡接头A、双链接头B和引物组;所述发卡接头A包括接头A1和接头A2,接头A1和接头A2的序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2,且接头A2的3′端用生物素修饰;所述双链接头B包括接头B1和接头B2,接头B1和接头B2的序列分别为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4;所述引物组包括扩增引物和接头引物,扩增引物的序列号为SEQIDNO.5,接头引物的序列为SEQIDNO.6-7。所述SEQIDNO.1-7所示的引物如下表所示:上述技术方案产生的有益效果在于:上述试剂盒提供了构建ctDNA文库需要的接头和特异性引物,可高效的制备用于illumina等测序平台的ctDNA文库,提高ctDNA测序通量和测序准确性。本专利技术的另一个目的是利用上述试剂盒构建ctDNA文库的方法,包括如下步骤:(1)提取游离ctDNA片段;(2)对ctDNA片段进行去磷酸化与变性反应;(3)将步骤(2)中的产物和T4DNA连接酶、发卡接头A混合进行接头连接反应,并进行纯化;(4)将步骤(3)中的产物和引物混合进行退火和延伸反应,并进行纯化;(5)将步骤(4)中的产物和T4DNA连接酶、双链接头B混合进行接头连接反应,并进行纯化、洗脱;(6)将步骤(5)中的产物和接头引物混合进行PCR扩增,得到ctDNA文库。DNA文库制备是高通量测序的核心环节,文库的产量与质量直接决定了测序数据的产量与质量。附图说明图1是本专利技术的建库方法原理图;具体实施方式为进一步说明本专利技术公开的技术方案,以下通过2个实施例来说明:实施例1:ctDNA建库试剂盒本专利技术提供了一种ctDNA建库试剂盒产品,在试剂盒中包括有:用于连接和标识变性后的单链ctDNA的发卡接头A,所述发卡接头A包括接头A1和接头A2,且接头A2的3′端用生物素修饰;用于连接单链ctDNA和发卡接头A或双链接头B的T4DNA连接酶和用于T4DNA连接酶的缓冲液;用于连接双链ctDNA的双链接头B,所述双链接头B包括接头B1和接头B2;用于扩增ctDNA的扩增引物CL130和用于扩增文库分子以进行文库检测的接头引物IS7和IS8:其中,所述发卡接头A由如下方法制得:对如下体系进行PCR,95℃反应10s,然后以0.1℃/s降温到14℃,得到双链接头A。所述双连接头B由如下方法制得:对如下体系进行PCR,95℃反应10s,然后以0.1℃/s降温到14℃,得到双链接头B。反应体系如下:所述试剂盒还包括如下试剂:缓冲A液(50ml):缓冲B液(50ml):严谨性洗脱缓冲液(50ml):49.5ml灭菌蒸馏水250μl20%(wt/vol)SDS250μl20×SSCbuffer;终止液(100μl):98μl0.5MEDTA(pH8.0)2μlTween20;TE缓冲液(50ml):49.4ml灭菌蒸馏水500μl1MTris-Hcl(PH8.0)100μl0.5MEDTA(PH8.0);TET缓冲液(50ml):在使用中为了更加进一步增加试剂盒的便易性,在试剂盒中还可以添加如下成分:10×T4RNAligationbuffer,2%Tween,FastAP,PEG-8000(50%),T4DNAligase,100mMATP,5×Klenowreactionbuffer,dNTPmix(25mMeach),ExtensionprimerCL130(100μM),1%Tween-20,10×T4DNAligationbuffer,PEG-4000(50%),Library,Mix。实施例2:一种ctDNA建库的方法,包括如下步骤:(1)提取游离ctDNA片段根据QIAGEN公司提供的QIAampCirculatingNucleicAcidKit(50)试剂盒的使用说明书,使用该试剂盒对血浆中游离的ctDNA进行提取,得到ctDNA。(2)对ctDNA片段进行去磷酸化与变性反应向PCR管中加入如下成分:使用PCR仪,先37℃反应10min,然后95℃反应2min;取出PCR管,迅速将其放入到冰水混合物中,冰浴至少1min,取出后离心,室温保存,得到去磷酸化与变性后的ctDNA。(3)将步骤(2)中的产物和发卡接头A混合进行接头连接反应,并进行纯化向PCR管中加入如下成分:使用PCR仪,先37℃反应1h,然后95℃反应1min;连接产物在-20℃下保存;通过涡流悬浮磁珠,向1.5ml离心管中转移12μl磁珠;用磁力架固定磁珠,移去上清液,用500μl的磁珠缓冲液分两次冲洗磁珠(每次250μl);使用PCR仪,连接产物在95℃下反应1min;迅速对连接产物冰浴至少1min,取出离心;将连接产物转移至含有磁珠的离心管中,室温旋转20min,离心;用磁力架固定磁珠,移去上清液,磁珠依次用200μl的缓冲A液和缓冲B液冲洗。(4)将步骤(3)中的产物和引物混合进行退火和延伸反应,并进行纯化用磁力架固定磁珠,移去上清液,加入如下成分,操作过程中通过涡流悬浮磁珠;将上述体系置于65℃的恒温金属浴中热处理2min,再冰浴1min;加入2μl的Klenowfragment,混匀,37℃的恒温金属浴中热处理27min,取出离心;用磁力架固定磁珠,移去上清液,用200μl的缓冲A液冲洗一次;将磁珠重悬在100μl的严谨性洗脱缓冲液中,然后将该体系置于45℃的恒温金属浴上热处理3min;用磁力架固定磁珠,移去上清液,用200μl的缓冲B液冲洗一次。(5)将步骤(4)中的产物和双链接头B混合进行接头连接反应,并进行纯化、洗脱用磁力架固定磁珠,移去上清液,加入如下成分,操作过程中通过涡流悬浮磁珠;对上述体系震荡混匀,加入2μlT4DNALigase,混匀,室温反应30min;用磁力架固定磁珠,移去上清液,用200μl的缓冲A液冲洗一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ctDNA建库试剂盒,其特征在于,包括发卡接头A、双链接头B和引物组;所述发卡接头A包括接头A1和接头A2,接头A1和接头A2的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2,且接头A2的3′端用生物素修饰;所述双链接头B包括接头B1和接头B2,接头B1和接头B2的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;所述引物组包括扩增引物和接头引物,扩增引物的序列号为SEQ ID NO.5,接头引物的序列为SEQ ID NO.6‑7。

【技术特征摘要】
1.一种ctDNA建库试剂盒,其特征在于,包括发卡接头A、双链接头B和引物组;所述发卡接头A包括接头A1和接头A2,接头A1和接头A2的序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2,且接头A2的3′端用生物素修饰;所述双链接头B包括接头B1和接头B2,接头B1和接头B2的序列分别为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4;所述引物组包括扩增引物和接头引物,扩增引物的序列号为SEQIDNO.5,接头引物的序列为SEQIDNO.6-7。2.根据权利要求1所述的ctDNA建库试剂盒,其特征在于,还包括用于连接ctDNA和发卡接头A或双链接头B的T4DNA连接酶和用于T4DNA连接酶的缓冲液。3.一种ctDNA建库的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)提取游离ctDNA片段;(2)对ctDNA片段进行去磷酸化与变性反应;(3)将步骤(2)中的产物和T4DNA连接酶、发卡接头A混合进行接头连接反应,并进行纯化;(4)将步骤(3)中的产物和引物混合进行退火和延伸反应,并进行纯化;(5)将步骤(4)中的产物和T4DNA连接酶、双链接头B混合进行接头连接反应,并进行纯化、洗脱;(6)将步骤(5)中的产物和接头引物混合进行PCR扩增,得到ctDNA文库。4.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法,其特征在于,还包括(7)对ctDNA文库进行测序。5.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的反应体系为:ctDNA20μl...

【专利技术属性】
技术研发人员:岳磊宋礼华杨楠宋社吾饶海军华晓君
申请(专利权)人:安徽安科生物工程集团股份有限公司
类型:发明
国别省市:安徽,34

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