利用免疫共沉淀从苹果花粉管中获得级联激酶蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用免疫共沉淀从苹果花粉管中获得级联激酶蛋白的方法。本发明专利技术属于分子生物学和基因功能领域，涉及2个在苹果花粉管生长过程中发挥重要调控作用的促分裂原活化蛋白质激酶MdMAPK3和MdMAPKK4基因，MdMAPK3基因含有1110个核苷酸，编码370个氨基酸，属于MAPK家族成员；MdMAPKK4基因含有1068个核苷酸，编码356个氨基酸，属于MAPKK家族成员。本发明专利技术公开了在苹果自交不亲和反应中，由花粉管蛋白激酶MdMAPK3筛选上游蛋白激酶MdMAPKK4并验证其互作关系的方法。

【技术实现步骤摘要】
利用免疫共沉淀从苹果花粉管中获得级联激酶蛋白的方法
本专利技术属于分子生物学和基因工程领域，涉及2个在苹果自交不亲和反应中发挥重要作用的促分裂原活化蛋白质激酶MdMAPK3和MdMAPKK4。具体为一种在苹果花粉管中利用蛋白质免疫共沉淀技术获得级联激酶蛋白的方法。
技术介绍
植物的自交不亲和性反应是一种花柱与花粉间的特异性识别反应，以苹果为代表的蔷薇科果树自交不亲和产生的机制是植物识别自我花粉，造成花粉管在花柱中难以生长至胚珠，不能完成双受精作用。目前，对于苹果自交不亲和机理的研究主要集中于花柱特异表达的S-RNase蛋白作为花柱决定因子，授粉后由花柱细胞特异产生，并在ABCF转运蛋白的协助下非特异性进入花粉管内，自我S-RNase作为“细胞毒素”分解花粉管内rRNA，使花粉管停止生长，最终导致花粉管在花柱生长过程中死亡，无法到达子房完成双受精作用；但随着对自交不亲和现象研究的不断深入，相继发现了众多的调控因子可能参与花粉管在花柱中的生长过程，然而目前尚未有蛋白激酶的相关报道。蛋白质激酶是一类可以使特定的蛋白质侧链中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基共价磷酸化的酶，蛋白质磷酸化可以控制酶的活性及其与其他分子的相互作用。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)在植物的胁迫反应应答方面占有重要地位。真核生物(酵母、动物和植物)中与MAPK级联途径有关的激酶均为丝/苏氨酸磷酸酶，其基本组成为三级激酶模式，即上游的促分裂原活化蛋白质激酶(MAPKKK)通过将促分裂原活化蛋白质激酶(MAPKK)中保守区域中丝/苏氨酸残基磷酸化而激活MAPKKK，再由MAPKK通过磷酸化MAPK第七和第八亚结构域之间的丝/苏氨酸和酪氨酸残基激活MAPK。MAPK既可以作为信号转导的一个环节继续磷酸化下游的成分，又可以进入细胞核激活转录因子进而调节基因表达。目前已有报道表明，拟南芥的AtMPK3和AtMPK4在花粉管生长过程中具有重要作用。迄今为止，尚未有促分裂原活化蛋白质激酶参与苹果自交不亲和反应和参与调控苹果花粉管生长的相关报道。
技术实现思路
本专利技术公开了一种苹果花粉管MAPK类蛋白激酶MdMAPK3基因，所述蛋白激酶MdMAPK3基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还公开了蛋白激酶MdMAPK3基因编码的蛋白激酶MdMAPK3，所述蛋白激酶MdMAPK3的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。所述蛋白激酶MdMAPK3的氨基酸序列中含有保守的STKc_TEY结构域，该结构域能被上游MAPKK家族蛋白激酶结合并被磷酸化。本专利技术提供了一种苹果花粉管MAPKK类蛋白激酶MdMAPKK4基因，所述蛋白激酶MdMAPKK4基因的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术还公开了蛋白激酶MdMAPKK4基因编码的蛋白激酶MdMAPKK4，所述蛋白激酶MdMAPKK4的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。所述蛋白激酶MdMAPKK4氨基酸序列中含有保守的PKc_MAPKK结构域，该结构域能与上游MAPKKK类蛋白激酶结合并被磷酸化。本专利技术提供了一种从苹果花粉管中获得级联蛋白激酶的方法，包括以下步骤：1)体外模拟自交不亲和反应体系，处理苹果花粉管；2)低速离心收集苹果花粉管，预冷的PBS冲洗花粉管后，液氮磨样，提取苹果花粉管总蛋白；3)构建MdMAPK3的原核表达载体，利用蛋白质免疫共沉淀筛选上游激酶蛋白；4)对与MdMAPK3结合的互作激酶蛋白进行核苷酸和氨基酸序列分析；5)利用酵母双杂交互作验证苹果花粉管蛋白激酶MdMAPK3与MdMAPKK4的结合能力。在上述方案的基础上，步骤1)的具体操作为：将苹果花粉分散于液体培养基表面，水合15min后，添加自我S-RNase蛋白，置于23℃培养箱中暗培30-50min进行萌发培养，待花粉管长度长至20-30μm，停止萌发培养。在上述方案的基础上，步骤3)的具体操作为：构建MdMAPK3-pet30a原核表达载体，经37℃摇菌至菌液浓度OD＝0.6，加IPTG诱导，转至16℃过夜诱导，收集菌液，经离心收集菌液-超声波破碎-离心收集菌液-与镍柱孵育-重力柱清洗杂蛋白，将与镍柱结合的清洗后的目的蛋白与花粉管总蛋白孵育2h后，清洗未与MdMAPK3结合的杂蛋白，洗脱MdMAPK3蛋白进行SDS-PAGE电泳后，切胶后进行蛋白质谱分析。在上述方案的基础上，步骤3)中通过蛋白质谱测定结果，获得了与苹果花粉管蛋白激酶MdMAPK3结合的上游蛋白激酶MdMAPKK4。本专利技术所述的苹果花粉管蛋白激酶MdMAPK3筛选上游调控蛋白激酶MdMAPKK4的方法，并利用酵母双杂交验证两者互作关系。本专利技术首先在苹果花粉管中克隆获得MdMAPK3蛋白激酶，并利用蛋白质免疫共沉淀技术从苹果‘金冠’中筛选到可以激活MdMAPK3的上游蛋白激酶信号因子MdMAPKK4，所获得的MdMAPKK4能够与MdMAPK3在花粉管内互作，从而参与苹果自交不亲和反应。附图说明本专利技术有如下附图：图1.苹果花粉管蛋白激酶MdMAPK3与拟南芥AtMAPK家族的进化树分析图。图2.苹果花粉管蛋白激酶MdMAPK3筛选蛋白激酶MdMAPKK4的免疫共沉淀质谱分析图。图3.苹果花粉管蛋白激酶MdMAPKK4与拟南芥AtMAPKK家族的进化树分析图。图4.酵母双杂交验证苹果花粉管蛋白激酶MdMAPK3与MdMAPKK4的结合能力示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。具体实验步骤如下：一、苹果花粉管总RNA的提取及cDNA的合成苹果花粉管总RNA提取方法1、苹果花粉管的萌发将苹果‘金冠’花粉分散于液体培养基表面，水合15min后，置于23℃培养箱中暗培30-50min进行萌发培养，待花粉管长度长至20-30μm，可停止萌发培养。2、苹果花粉管总RNA的提取低速离心收集苹果花粉管，预冷PBS冲洗花粉管3遍后，液氮磨样，用E.Z.N.A.TotalRNAKitIIOMEGARNA提取试剂盒，将提取的总RNA反转录成cDNA。二、苹果花粉管MdMAPK3基因筛选与克隆基于苹果基因组信息，blast检索苹果MAPK基因信息，获得苹果MAPK家族基因。以苹果‘金冠’花粉cDNA为模板进行扩增，PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃90s，共35个循环；72℃10min。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收后，连接至pMD19-Tsimple载体，并转化大肠杆菌Trans5α，送至北京中美泰和公司测序。三、序列分析通过核苷酸序列测定结果，获得了苹果花粉管MdMAPK3基因的序列，对其编码的氨基酸序列进行分析。氨基酸组成与多序列比对采用DNAman软件，进化树使用MEGA4.0软件。四、蛋白激酶MdMAPK3筛选花粉管中上游蛋白激酶苹果花粉管粗蛋白的提取1、体外模拟自交不亲和反应体系，处理苹果‘金冠’花粉管将苹果‘金冠’花粉分散于液体培养基表面，水合15min后，添加自我S-RNase(S2+S3-RNase)蛋白，置于23℃培养箱中暗培30-50min进行萌发培养，待花粉管长度长至20-30μm，可停止萌发培养。2、苹果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种苹果花粉管蛋白激酶MdMAPK3基因，其特征在于：所述蛋白激酶MdMAPK3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种苹果花粉管蛋白激酶MdMAPK3基因，其特征在于：所述蛋白激酶MdMAPK3基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.如权利要求1所述的蛋白激酶MdMAPK3基因编码的蛋白激酶MdMAPK3，其特征在于：所述蛋白激酶MdMAPK3的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.如权利要求2所述的蛋白激酶MdMAPK3，其特征在于：所述蛋白激酶MdMAPK3的氨基酸序列中含有保守的STKc_TEY结构域，所述结构域能被上游MAPKK家族蛋白激酶结合并被磷酸化。4.一种苹果花粉管蛋白激酶MdMAPKK4基因，其特征在于：所述蛋白激酶MdMAPKK4基因的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。5.如权利要求4所述的蛋白激酶MdMAPKK4基因编码的蛋白激酶MdMAPKK4，其特征在于：所述蛋白激酶MdMAPKK4的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。6.如权利要求5所述的蛋白激酶MdMAPKK4，其特征在于：所述蛋白激酶MdMAPKK4氨基酸序列中含有保守的PKc_MAPKK结构域，所述结构域能与上游MAPKKK类蛋白激酶结合并被磷酸化。7.一种从苹果花粉管中获得级联蛋白激酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)体外模拟自交不亲和反应体系，处理苹果花粉管；2)低速离心收集苹果花粉管，预冷的PBS冲洗花粉管后，液氮磨样，提取苹果花粉管总...

【专利技术属性】
技术研发人员：李天忠，顾钊宇，杨清，李威，于杰，刘春生，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11