【技术实现步骤摘要】
沉默荣昌猪CD14表达的siRNA及筛选方法与应用
本专利技术属于生物基因工程及生物技术药物
,具体涉及一种沉默荣昌猪CD14表达的小核糖核酸分子(siRNA),本专利技术还涉及一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法与应用。
技术介绍
白细胞分化抗原14(clusterofdifferentiationantigen14,CD14)即为脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)高亲和性受体,借助于糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinosi-tol,GPI)锚固于单核细胞、巨噬细胞等髓样细胞膜的表面,CD14分为两种:膜结合型CD14(membraneCD14,mCD14)和可溶性CD14(solubleCD14,sCD14)。mCD14是一种分子量大小为55kD的膜蛋白,主要分布于单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的表面,被激活的中性粒细胞表面也有少量的mCD14;sCD14是一种糖蛋白,其分子量大小约为48kD,主要存在于正常人和动物的血浆中。CD14主要功能是识别并结合LPS,或与LPS结合蛋白(LPS-bindingprotein,LBP)形成复合物,激活Toll样受体4(Toll-likereceptor4,TLR4)信号通路,使之发生同源二聚化,然后通过两种途径激活靶细胞,实现LPS信号的跨膜转导,在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。因此,如果能够特异性地阻断CD14与LPS及LPS-LBP复合物的结合,就能够防治LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应的发生,对于临床治疗内毒素血症、 ...
【技术保护点】
1.一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA,其特征在于,所述小核糖核酸分子siRNA的序列信息为:正义,AUUGUCAGAUAGGUCCAGGGU(5′–3′);反义,CCUGGACCUAUCUGACAAUCC(5′–3′)。
【技术特征摘要】
1.一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA,其特征在于,所述小核糖核酸分子siRNA的序列信息为:正义,AUUGUCAGAUAGGUCCAGGGU(5′–3′);反义,CCUGGACCUAUCUGACAAUCC(5′–3′)。2.如权利要求1所述的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1,构建重组表达质粒pCD14-EGFP;步骤2,构建稳定表达荣昌猪CD14基因的CD14-EGFP稳定细胞系;步骤3,根据CD14基因的序列,合成针对CD14基因的四个小干扰核糖核酸分子siRNAs;步骤4,使用高效转染试剂,将步骤3中四条siRNAs转染步骤2的CD14-EGFP稳定细胞系;步骤5,经过步骤4的转染36h后,利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测siRNA的抑制效果,从而筛选出其中能特异且最有效沉默荣昌猪CD14基因表达的siRNA。3.根据权利要求2所述的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法,其特征在于,所述步骤1具体为:步骤1.1,根据猪CD14基因序列,同时参照pEGFP-N1载体信息,设计CD14真核表达引物F、R,并将pEGFP-N1载体多克隆位点上的ApaI和EcoRI分别作为上、下游引物的酶切位点;其中,CD14真核表达引物F、R具体为:F:5’-GCGCGGGCCCATGGTGAGTGTGTGCACGAGG-3’;R:5’-CGCGGAATTCTTAGGCGAAGCCCCGGG-3’;所述真核表达引物F、R中下划线位置处分别为pEGFP-N1载体多克隆位点上的ApaI和EcoRI的上、下游引物的酶切位点;步骤1.2,以cDNA为模板,取步骤1.1中真核表达引物F、R进行降落PCR扩增CD14CDS编码区,随后将扩增出的目的片段电泳,最后纯化回收扩增出的目的片段;步骤1.3,将步骤1.1的pEGFP-N1载体与步骤1.2的目的片段同时经ApaI和EcoRI双酶切消化,经电泳回收到线性化载体与扩增产物;然后在T4DNA连接酶的介导下4℃过夜连接,将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经IPTG蓝白斑筛选,挑取单克隆进行菌落PCR初步鉴定,将阳性重组子摇菌,提取质粒,ApaI和EcoRI双酶切鉴定,测序得到重组表达质粒pCD14-EGFP。4.根据权利要求3所述的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法,其特征在于,所述步骤1.2中扩增CD14CDS编码区反应总体系50μL:模板cDNA0.5μL,上、下游引物各1μL,2×TaqPCRMasterMix26μL,灭菌蒸馏水21.5μL;降落PCR扩增条件为:95℃预变性2min,94℃变性20s、58℃退火20s,72℃延伸3min;依次循环以上扩增条件;当从第2个循环开始,每个循环降落1℃,直至退火温度降到50℃,再按照95℃预变性2min,94℃变性20s,50℃退火20s,72℃延伸3min进行30个循环反应;最后,72℃后延伸15min。5.根据权利要求2所述的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法,其特征在于,所述...
【专利技术属性】
技术研发人员:焦寒伟,万堃,黄庆洲,伍莉,陈吉轩,帅学宏,赵宇,王红均,
申请(专利权)人:西南大学,
类型:发明
国别省市:重庆,50
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