沉默荣昌猪CD14表达的siRNA及筛选方法与应用技术

本发明专利技术公开的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA，通过先建立稳定表达荣昌猪CD14基因的CD14‑增强型绿色荧光蛋白EGFP融合蛋白的猪肺泡巨噬细胞；然后合成四条位点不同的靶向CD14基因的siRNAs，再应用高效转染试剂将四条siRNAs，转染CD14‑EGFP稳定细胞系；最后筛选出能高效抑制荣昌猪CD14基因表达的siRNAs，即第3条(669)siRNAs能够明显抑制荣昌猪CD14基因的表达，为开展靶向荣昌猪CD14的基因治疗荣昌猪内毒素休克、内毒素血症以及格兰氏阴性菌导致的炎症性疾病的相关研究提供了的理论依据。

【技术实现步骤摘要】
沉默荣昌猪CD14表达的siRNA及筛选方法与应用
本专利技术属于生物基因工程及生物技术药物
，具体涉及一种沉默荣昌猪CD14表达的小核糖核酸分子(siRNA)，本专利技术还涉及一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法与应用。
技术介绍
白细胞分化抗原14(clusterofdifferentiationantigen14，CD14)即为脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)高亲和性受体，借助于糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinosi-tol，GPI)锚固于单核细胞、巨噬细胞等髓样细胞膜的表面，CD14分为两种：膜结合型CD14(membraneCD14，mCD14)和可溶性CD14(solubleCD14，sCD14)。mCD14是一种分子量大小为55kD的膜蛋白，主要分布于单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的表面，被激活的中性粒细胞表面也有少量的mCD14；sCD14是一种糖蛋白，其分子量大小约为48kD，主要存在于正常人和动物的血浆中。CD14主要功能是识别并结合LPS，或与LPS结合蛋白(LPS-bindingprotein，LBP)形成复合物，激活Toll样受体4(Toll-likereceptor4，TLR4)信号通路，使之发生同源二聚化，然后通过两种途径激活靶细胞，实现LPS信号的跨膜转导，在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。因此，如果能够特异性地阻断CD14与LPS及LPS-LBP复合物的结合，就能够防治LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应的发生，对于临床治疗内毒素血症、内毒素休克将会有非常重大的意义。荣昌猪遗传资源丰富，肉质、鬃质和毛色特性优良，近年来开展了较为全面的遗传资源保护与开发利用工作。荣昌猪主要产于重庆市荣昌区和四川省的隆昌县而闻名，至今已有400多年的历史。在1986年，荣昌猪就被列入《中国猪品种志》，2003年农业部将其列入国家级保种名录，2006年农业部又将其列入《国家级畜禽遗传资源保护名录》。针对荣昌猪CD14基因介导的信号通路和调控临床疾病分子机制的研究，几乎没有相关报道。猪CD14基因位于第二号染色体上，可编码373个氨基酸，Liu等报道了猪CD14基因存在-61、587和1246等3个多态位点，并分析了-61位点的3种基因型与IgG、DTH等部分免疫性状之间的关系，结果发现：各免疫性状在不同基因型之间差异不显著。吴嘉韵等将梅山猪CD14基因-61位点的多态性与繁殖性能进行关联分析，也发现其不能作为繁殖性能的分子遗传标记。核糖核酸干扰(RNAinterference，RNAi)是指由特定双链核糖核酸(doublestrandedRNA，dsRNA)引发同源信使核糖核酸(messengerRNA，mRNA)降解的转录后基因沉默机制。这类特定双链核糖核酸被裂解成小干扰核糖核酸分子(siRNAs)，并能导致同源信使核糖核酸在核糖核酸诱导的静默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)作用下降解。核糖核酸干扰RNA是目前简单而高效地阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法之一，可达到基因敲除效果，且安全性好。但对于核糖核酸干扰来说，并不是所有针对靶基因信使核糖核酸序列随机设计的siRNAs都能引起有效的基因沉默，干扰靶序列的选择对干扰效率的影响是至关重要的。因此，对能有效抑制特异基因表达的siRNAs的筛选是应用核糖核酸干扰技术进行基因功能、基因治疗等相关研究的重要基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA，能够有效沉默荣昌猪CD14基因的表达，为开展靶向荣昌猪CD14的基因治疗荣昌猪内毒素休克、内毒素血症以及格兰氏阴性菌导致的炎症性疾病的研究提供了依据。本专利技术的第二个目的是提供一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法。本专利技术的第三个目的是提供一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的应用。本专利技术所采用的第一个技术方案是，一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA，siRNA的序列信息为：正义，AUUGUCAGAUAGGUCCAGGGU(5′–3′)；反义，CCUGGACCUAUCUGACAAUCC(5′–3′)。本专利技术所采用的第二个技术方案是，一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法，包括以下步骤：步骤1，构建重组表达质粒pCD14-EGFP；步骤2，构建稳定表达荣昌猪CD14基因的CD14-EGFP稳定细胞系；步骤3，根据CD14基因的序列，合成针对CD14基因的四个siRNAs；步骤4，使用高效转染试剂，将步骤3中四条siRNAs转染步骤2的CD14-EGFP稳定细胞系；步骤5，经过步骤4的转染36h后，利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测siRNA的抑制效果，从而筛选出其中能特异且最有效沉默荣昌猪CD14基因表达的siRNA。本专利技术的特征还在于，步骤1具体为：步骤1.1，根据猪CD14基因序列，同时参照pEGFP-N1载体信息，设计CD14真核表达引物F、R，并将pEGFP-N1载体多克隆位点上的ApaI和EcoRI分别作为上、下游引物的酶切位点；其中，CD14真核表达引物F、R具体为：F:5’-GCGCGGGCCCATGGTGAGTGTGTGCACGAGG-3’；R:5’-CGCGGAATTCTTAGGCGAAGCCCCGGG-3’；真核表达引物F、R中下划线位置处分别为pEGFP-N1载体多克隆位点上的ApaI和EcoRI的上、下游引物的酶切位点；步骤1.2，以cDNA为模板，取步骤1.1中真核表达引物F、R进行降落PCR扩增CD14CDS编码区，随后将扩增出的目的片段电泳，最后纯化回收扩增出的目的片段；步骤1.3，将步骤1.1的pEGFP-N1载体与步骤1.2的目的片段同时经ApaI和EcoRI双酶切消化，经电泳回收到线性化载体与扩增产物；然后在T4DNA连接酶的介导下4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经IPTG蓝白斑筛选，挑取单克隆进行菌落PCR初步鉴定，将阳性重组子摇菌，提取质粒，ApaI和EcoRI双酶切鉴定，测序得到重组表达质粒pCD14-EGFP。步骤1.2中扩增CD14CDS编码区反应总体系50μL：模板cDNA0.5μL，上、下游引物各1μL，2×TaqPCRMasterMix26μL，灭菌蒸馏水21.5μL；降落PCR扩增条件为：95℃预变性2min，94℃变性20s、58℃退火20s，72℃延伸3min；依次循环以上扩增条件；当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到50℃，再按照95℃预变性2min，94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸3min进行30个循环反应；最后，72℃后延伸15min。步骤2的具体步骤为：步骤2.1，将猪肺泡巨噬细胞在含体积分数10％的FBS的杜比克改良伊格氏完全培养基中，于温度37℃、5％的CO2的饱和湿度下培养，在转染的前一天，计数猪肺泡巨噬细胞并铺于6孔板中，确保转染时细胞密度达到80-90％；步骤2.2，用250μL无血清的优化改良伊格氏完全培养基I分别稀释2.5μg步骤1重组表达质粒pCD14-EGFP和8μL转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA，其特征在于，所述小核糖核酸分子siRNA的序列信息为：正义，AUUGUCAGAUAGGUCCAGGGU(5′–3′)；反义，CCUGGACCUAUCUGACAAUCC(5′–3′)。

【技术特征摘要】
1.一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA，其特征在于，所述小核糖核酸分子siRNA的序列信息为：正义，AUUGUCAGAUAGGUCCAGGGU(5′–3′)；反义，CCUGGACCUAUCUGACAAUCC(5′–3′)。2.如权利要求1所述的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，构建重组表达质粒pCD14-EGFP；步骤2，构建稳定表达荣昌猪CD14基因的CD14-EGFP稳定细胞系；步骤3，根据CD14基因的序列，合成针对CD14基因的四个小干扰核糖核酸分子siRNAs；步骤4，使用高效转染试剂，将步骤3中四条siRNAs转染步骤2的CD14-EGFP稳定细胞系；步骤5，经过步骤4的转染36h后，利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测siRNA的抑制效果，从而筛选出其中能特异且最有效沉默荣昌猪CD14基因表达的siRNA。3.根据权利要求2所述的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法，其特征在于，所述步骤1具体为：步骤1.1，根据猪CD14基因序列，同时参照pEGFP-N1载体信息，设计CD14真核表达引物F、R，并将pEGFP-N1载体多克隆位点上的ApaI和EcoRI分别作为上、下游引物的酶切位点；其中，CD14真核表达引物F、R具体为：F:5’-GCGCGGGCCCATGGTGAGTGTGTGCACGAGG-3’；R:5’-CGCGGAATTCTTAGGCGAAGCCCCGGG-3’；所述真核表达引物F、R中下划线位置处分别为pEGFP-N1载体多克隆位点上的ApaI和EcoRI的上、下游引物的酶切位点；步骤1.2，以cDNA为模板，取步骤1.1中真核表达引物F、R进行降落PCR扩增CD14CDS编码区，随后将扩增出的目的片段电泳，最后纯化回收扩增出的目的片段；步骤1.3，将步骤1.1的pEGFP-N1载体与步骤1.2的目的片段同时经ApaI和EcoRI双酶切消化，经电泳回收到线性化载体与扩增产物；然后在T4DNA连接酶的介导下4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经IPTG蓝白斑筛选，挑取单克隆进行菌落PCR初步鉴定，将阳性重组子摇菌，提取质粒，ApaI和EcoRI双酶切鉴定，测序得到重组表达质粒pCD14-EGFP。4.根据权利要求3所述的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法，其特征在于，所述步骤1.2中扩增CD14CDS编码区反应总体系50μL：模板cDNA0.5μL，上、下游引物各1μL，2×TaqPCRMasterMix26μL，灭菌蒸馏水21.5μL；降落PCR扩增条件为：95℃预变性2min，94℃变性20s、58℃退火20s，72℃延伸3min；依次循环以上扩增条件；当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到50℃，再按照95℃预变性2min，94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸3min进行30个循环反应；最后，72℃后延伸15min。5.根据权利要求2所述的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦寒伟，万堃，黄庆洲，伍莉，陈吉轩，帅学宏，赵宇，王红均，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50