一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒制造技术

本发明专利技术属于动物病毒学和基因工程技术领域，具体涉及一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒。将牛传染性鼻气管炎病毒免疫原性gD基因胞外区插入到牛传染性鼻气管炎△gG/△TK双基因缺失毒株的TK基因位置，表达出双拷贝gD基因。该重组病毒的增殖没有改变，但其免疫原性得到提高。重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/gD+，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201552，本发明专利技术还公开了重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/gD+在制备牛传染性鼻气管炎基因工程疫苗中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒
本专利技术属于动物病毒学和基因工程
，具体涉及一种表达双拷贝gD基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒。本专利技术将牛传染性鼻气管炎病毒免疫原性最好的gD蛋白基因胞外区插入到牛传染性鼻气管炎△gG/△TK双基因缺失疫苗毒株的TK基因位置，表达出双拷贝gD基因。该重组病毒的增殖没有改变，但其免疫原性得到提高。本专利技术还包括利用该重组病毒制备牛传染性鼻气管炎病毒疫苗及其应用。
技术介绍
牛传染性鼻气管炎(Infectiousbovinerhinotracheitis，IBR)又称“红鼻病”，“坏死性鼻炎”，是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectiousbovinerhinotracheitis，IBRV)或称牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovineherpesvirus1，BoHV‐1)感染牛引起的一种急性、热性、接触性传染病，主要临床特征为上呼吸道及气管炎、黏膜炎、高热、流鼻汁、呼吸困难等，是引起牛呼吸道疾病综合征(Bovinerespiratorydiseasecomplex，BRDC)的病原之一，给世界养牛业造成了巨大损失(JonesandChowdhury,2007)。此外，IBRV感染机体后可潜伏感染于三叉神经节，当机体受到应激因素刺激时病毒被激活增殖，导致扩散和传播并致病，给该病的控制和消灭带来了极大困难(Nuotioetal.,2007)。目前只有少数欧洲国家已经根除了本病，其他一些国家正在实施扑灭计划，或使用标记疫苗区分自然感染和疫苗接种的牛群，以便于更好的进行监控和防制。此外，IBRV可作为活病毒载体表达其他重要病原的免疫原性基因研制重组多价疫苗，达到“一针防多病”的目的。IBRV病毒有囊膜，球形，病毒粒子由核酸芯髓、衣壳和囊膜组成，核衣壳内含有双链DNA。病毒粒子的直径约120‐200nm。衣壳为正二十面体立体对称，外观呈六角形，有162个壳粒，其中包括150个六聚体和12个五聚体，壳粒互相连接呈放射状排列且有中空轴孔。IBRV的基因组约135kb，G+C含量为72％。IBRV的基因组结构中，两个反向重复序列(IRS和TRS，各为11kb)位于短独特区(US，13kb)的两侧，序列相同方向相反，因而短区能够反转方向，使病毒DNA具有两种异构体(MittalandField,1989)。IBRV基因组有73个编码框(Openreadingframe，ORF)，编码73个蛋白质。按病毒在体外细胞培养增殖的重要性分类，属于复制增殖必需的蛋白有33个，包括糖蛋白gB、gD、gH、gL和gK等；非必需蛋白有36个，包括糖蛋白(gC、gE、gI、gG、gM)、胸苷激酶蛋白(TK)、脱氧尿苷三磷酸酶蛋白、包膜蛋白(UL49、US9)、膜蛋白(UL49.5)和调节蛋白(US3、bICP0、bICP22、Circ)等(Robinsonetal.,2008)；按是否为病毒结构组分进行分类，可分为结构蛋白和非结构蛋白，结构蛋白有33个，其中13个为包膜蛋白，约10个为糖蛋白(SchwyzerandAckermann,1996)。这10个糖蛋白中，6个位于UL区，为gK(UL53)、gC(UL44)、gB(UL27)、gH(UL22)、gM(UL10)和gL(UL1)，而另外4个糖蛋白位于US区，为gG(US4)、gD(US6)、gI(US7)和gE(US8)(Muylkensetal.，2007)。gD基因是由US6基因编码，gD蛋白通过与细胞表面的连接蛋白受体结合，参与病毒感染早期的吸附过程，为必需蛋白。病毒在细胞之间扩散也需要gD的参与，因为gD缺失后病毒失去向周围细胞扩散的能力。尽管gD对于病毒侵入细胞过程是必需的，但当gH的450位氨基酸突变时，gD的这个功能得到补偿(AlvesDummeretal.,2014)。针对gD基因3’端氨基酸序列和核酸构建进化树，可区分IBRV(呼吸道型和生殖道型)和BoHV‐5(神经型)(Traeseletal.,2014)。gD是IBRV免疫原性最好的糖蛋白，能诱导体液免疫和细胞免疫应答，因此是制备亚单位疫苗的首选蛋白(Brownlieetal.,2015；Kumaretal.,2014；Ferreretal.,2011；Khattaretal.,2010)。近年来，很多学者用病毒或细菌作为载体表达gD基因，如牛痘病毒(Ferreretal.,2011)、腺病毒(Brownlieetal.,2015；Kumaretal.,2014)、HSV(Blancetal.,2012)、沙门氏菌(Gnazzoetal.,2012)、新城疫病毒(Khattaretal.,2010)、BoHV‐4(Donofrioetal.,2008；Donofrioetal.,2006)、杆状病毒(Peraltaetal.,2007)、烟草花叶病病毒(PerezFilgueiraetal.,2003)等，都能诱导高水平的免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫，以及提供良好的保护力。此外，由于gD具有良好的免疫原性，也被用来制备各种DNA疫苗(Casellietal.,2005；Castruccietal.,2004；AlvesDummeretal.,2014)，能提供高于gC的保护力(Toussaintetal.,2005a)；IBRVgD的DNA疫苗还可作为IBRV灭活疫苗的增强剂，诱导高水平的Th2型免疫反应(Toussaintetal.,2005b)。gG基因是由US4基因编码，在α‐疱疹病毒中高度保守，是病毒复制非必需的分泌型蛋白，gG经O和N糖基化后形成可形成两种形式的蛋白，为70kD的蜂窝状蛋白或65kD的分泌蛋白(Keiletal.,1996)。gG与病毒在细胞中间的扩散有关，当缺失gG时，病毒空斑变小，病毒生长受到抑制(Nakamichietal.,2000)。这可能由于gG与gE在细胞结合的侧缘定位有关，因为gG缺失后影响gE或gE‐gI复合物的形成，最终影响病毒在细胞之间的传递(Nakamichietal.,2002)。此外，gG在病毒感染过程中对维持细胞与细胞的结合与粘连有关(Nakamichietal.,2002)。gG可通过阻止趋化因子与特异性受体的结合或高亲和力的直接与趋化因子结合(Bryantetal.,2003)，导致病毒感染机体后造成免疫抑制(Nandietal.,2009)。gG蛋白具有很强的抗原性，已被广泛用于诊断抗原(Yanetal.,2008)。gG缺失后，在牛体上的毒力下降，而且具有良好的免疫原性(Zhangetal.,2011；Belknapetal.,1999；Kaashoeketal.,1998；Denisetal.,1996)。由于gG具有以上特性—病毒复制非必需、与毒力和免疫抑制有关以及可作为诊断抗原，因此本研究小组研制了新型基因缺失疫苗：IBRV△gG/△TK基因缺失疫苗(Zhangetal.,2011)。TK基因是由UL23基因编码，在疱疹病毒科病毒均编码胸腺激酶，该酶在核酸代谢中期重要作用，但对病毒复制非必需(LiuandManning,1986；Belloetal.,1987；MittalandF本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/gD+，其特征在于，该病毒含有双拷贝的gD基因，即在缺失的TK基因位置上插入一拷贝gD基因胞外区，该病毒保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201552；所述的gD基因胞外区的核苷酸序列如下所示。CAAGGGCCGACATTGGCCGTGCTGGGCGCGCTGCTCGCCGTTGCGGTGAGCTTGCCTACACCCGCGCCGCGGGTGACGGTATACGTCGACCCGCCGGCGTACCCGATGCCGCGATACAACTACACTGAACGCTGGCACACTACCGGGCCCATACCGTCGCCCTTCGCAGACGGCCGCGAGCAGCCCGTCGAGGTGCGCTACGCGACGAGCGCGGCGGCGTGCGACATGCTGGCGCTGATCGCAGACCCGCAGGTGGGGCGCACGCTGTGGGAAGCGGTACGCCGGCACGCGCGCGCGTACAACGCCACGGTCATATGGTACAAGATCGAGAGCGGGTGCGCCCGGCCGCTGTACTACATGGAGTACACCGAGTGCGAGCCCAGGAAGCACTTTGGGTACTGCCGCTACCGCACACCCCCGTTTTGGGACAGCTTCCTGGCGGGCTTCGCCTACCCCACGGACGACGAGCTGGGACTGATTATGGCGGCGCCCGCGCGGCTCGTCGAGGGCCAGTACCGACGCGCGCTGTACATCGACGGCACGGTCGCCTATACAGATTTCATGGTTTCGCTGCCGGCCGGGGACTGCTGGTTCTCGAAACTCGGCGCGGCTCGCGGGTACACCTTTGGCGCGTGCTTCCCGGCCCGGGATTACGAGCAAAAGAAGGTTCTGCGCCTGACGTATCTCACGCAGTACTACCCGCAGGAGGCACACAAGGCCATAGTCGACTACTGGTTCATGCGCCACGGGGGCGTCGTTCCGCCGTATTTTGAGGAGTCGAAGGGCTACGAGCCGCCGCCTGCCGCCGATGGGGGTTCCCCCGCGCCACCCGGCGACGACGAGGCCCGCGAGGATGAAGGGGAGACCGAGGACGGGGCAGCCGGGCGGGAGGGCAACGGCGGCCCCCCAGGACCCGAAGGCGACGGCGAGAGTCAGACCCCCGAAGCCAACGGAGGCGCCGAGGGCGAGCCGAAACCCGGCCCCAGCCCCGACGCCGACCGCCCCGAAGGCTGGCCGAGCCTCGAAGCCATCACGCACCCCCCGCCCGCCCCCGCTACGCCCGCGGCCCCCGACGCC。...

【技术特征摘要】
1.一株重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRV△gG/△TK/gD+，其特征在于，该病毒含有双拷贝的gD基因，即在缺失的TK基因位置上插入一拷贝gD基因胞外区，该病毒保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V201552；所述的gD基因胞外区的核苷酸序列如下所示。CAAGGGCCGACATTGGCCGTGCTGGGCGCGCTGCTCGCCGTTGCGGTGAGCTTGCCTACACCCGCGCCGCGGGTGACGGTATACGTCGACCCGCCGGCGTACCCGATGCCGCGATACAACTACACTGAACGCTGGCACACTACCGGGCCCATACCGTCGCCCTTCGCAGACGGCCGCGAGCAGCCCGTCGAGGTGCGCTACGCGACGAGCGCGGCGGCGTGCGACATGCTGGCGCTGATCGCAGACCCGCAGGTGGGGCGCACGCTGTGGGAAGCGGTACGCCGGCACGCGCGCGCGTACAACGCCACGGTCATATGGTACAAGATCGAGAGCGGGTGCGCCCGGCCGCTGTACTACATGGAGTACACCGAGTGCGAGCCCAGGAAGCACTTTGGGTACTGCCGCTACCGCACACCCCCGTTTTGGGACAGCTTCCTGGCGGGCTTCGCCTACCCCACGGACGACGAGCTGGGACTGATTATGGCGGCGCCCGCGCGGCTCGTCGAGGGCCAGTACCGACGCGCGCTGTACAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭爱珍，刘瑞宁，邓明亮，李汉雄，陈颖钰，胡长敏，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42