一种高纯度多拉菌素的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高纯度多拉菌素的制备方法，该方法将发酵液浸泡、分离，通过超滤膜进行纯化，再通过两次逆流萃取，得到的萃取液通过浓缩结晶。本发明专利技术的优点在于，工艺简单易行，得到的产品含量高。使用溶剂均全部可以通过较简单方式得到回收利用，生产成本降低，符合工艺绿色环保的大趋势。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度多拉菌素的制备方法
本专利技术属于工业微生物
，具体涉及一种制备高纯度多拉菌素的方法。
技术介绍
多拉菌素(doramectin，CAS号:117704-25-3)为20世纪90年代研制开发出的新一代大环内酯类抗寄生虫药，是以环已氨羧酸(cyclohexanecarboxylicacid)为前体，通过基因重组的阿维链霉菌(streptomycesavermitilis)新菌株发酵而成的一种阿维菌素类抗生素，是被认为目前阿维菌素族中最优秀的抗寄生虫药物之一，为内外兼杀剂，对线虫、节肢动物均有良好的驱杀效果，最早发现它驱杀寄生虫的能力是在驱鼠继代的蛇形毛圆线虫和杀兔痒螨的动物模型中，与其它市售的伊维菌素类产品比较，其抗寄生虫范围更广泛、效果更好，而且预防寄生虫再感染的有效时间更长，是目前具有开发潜力的兽用抗寄生虫药物。中国专利CN201310383711.7“一种多拉菌素的分离纯化方法”中采用多次结晶的方式，混合溶剂种类较多，回收困难，不利于环保，且多次结晶必然导致收率偏低。其次专利中对菌渣萃取液采用浓度成膏状的方法，在实际生产中由于菌渣含水量及含量较低的问题，浓缩到后期需要将其浓缩到膏状，耗费的能源是很高的。中国专利CN201310661993.2“一种高纯度多拉菌素的制备方法”中虽然对菌渣采用了干燥方法，降低了萃取液浓缩成膏状的难度，但是相应的干燥菌渣的动力成本依然不少。结晶溶剂依然难以常规方式回收，且得到产品的含量最高仅90％。
技术实现思路
为克服现有技术不足，本专利技术提供一种高纯度多拉菌素的制备方法，该方法将发酵液浸泡、分离，通过超滤膜进行纯化，再通过两次逆流萃取，得到的萃取液通过浓缩结晶。本专利技术方法工艺简单易行，得到的产品含量高；所使用溶剂均全部可以通过较简单方式得到回收利用，生产成本降低，符合工艺绿色环保的大趋势。本专利技术技术方案如下：一种高纯度多拉菌素的制备方法，包括以下步骤：1)将多拉菌素发酵液过滤(可通过常规压滤)，得到菌渣(主要为菌丝体)；2)向所得菌渣中加入极性溶剂，萃取，过滤，得到滤液；3)调整步骤2)所得滤液中极性溶剂和水的浓度，使滤液中所述极性溶剂的浓度为70-73％(体积分数)；过滤；4)将步骤3)所得滤液通过超滤膜进行超滤，得到超滤液；5)将步骤4)所得超滤液进入逆流萃取器与第一溶剂进行萃取交换；6)将步骤5)进行第一次逆流萃取交换后的超滤液再次进入逆流萃取器与第二溶剂进行萃取交换；7)将步骤6)所得萃取液(即进行逆流萃取后的非水溶性的第二溶剂萃取液)浓缩到晶体析出，降温、养晶、过滤得到晶体；8)将步骤7)所得晶体用丙酮溶解，滴加纯化水，降温、析晶、分离得到潮晶；9)将所得潮晶真空减压干燥，即得到高纯度的多拉菌素结晶粉。进一步地，步骤2)所述极性溶剂选自甲醇、乙醇等，优选为浓度75-80％(体积分数)甲醇溶液或乙醇溶液。进一步地，步骤2)中，以g/mL计，菌渣干重与浓度75-80％甲醇溶液或乙醇溶液的重量体积比为1:5-7。进一步地，步骤3)所用过滤介质的孔径≤0.22um；可采用除菌板过滤或者同样孔径的滤袋、钛棒过滤器；优选采用0.22um孔径的除菌板过滤。进一步地，步骤4)所述超滤膜的孔径为6000-5000道尔顿。进一步地，步骤5)所述第一溶剂选自甲苯、对二甲苯等；优选为甲苯。进一步地，步骤5)所述第一溶剂的用量为超滤液体积的1/3-1/2。进一步地，步骤6)所述第二溶剂为正庚烷和二氯甲烷的混合液，其中正庚烷与二氯甲烷的体积比例为1:3-1:1(例如1:3、1:2或1:1)；更进一步地，所述第二溶剂的用量为超滤液体积的1/4-1/2。进一步地，步骤7)所述浓缩温度为40-45℃，和/或，结晶温度为10℃-20℃，和/或，养晶时间为6-8小时。进一步地，步骤8)中，以g/mL计，潮晶与丙酮的重量体积比为1:4-5；和/或，所加入纯化水的量为丙酮体积的2.5-3倍。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术各原料均可市售获得。具体地，上述高纯度多拉菌素的制备方法，包括以下步骤：1)将多拉菌素发酵液过滤，得到菌渣(主要为菌丝体)；2)向所得菌渣中加入浓度75-80％(体积分数)甲醇溶液；萃取，过滤，得到滤液；以g/mL计，菌渣干重与浓度75-80％甲醇溶液的重量体积比为1:5-7；3)调整步骤2)所得滤液中极性溶剂和水的浓度，使滤液中所述极性溶剂的浓度为70-73％(体积百分数)；过滤；所用过滤介质的孔径≤0.22um；4)将步骤3)所得滤液通过孔径为6000-5000道尔顿的超滤膜进行超滤，得到超滤液；5)将步骤4)所得超滤液进入逆流萃取器与甲苯进行萃取交换；甲苯用量为超滤液体积的1/3-1/2；6)将步骤5)进行第一次逆流萃取交换后的超滤液再次进入逆流萃取器与第二溶剂进行萃取交换；所述第二溶剂为正庚烷和二氯甲烷的混合液，其中正庚烷与二氯甲烷的体积比例为1:3-1:1；所述第二溶剂的用量为超滤液体积的1/4-1/2；7)将步骤6)所得萃取液浓缩到晶体析出，降温、养晶、过滤得到晶体；所述浓缩温度为40-45℃，和/或，结晶温度为10℃-20℃，和/或，养晶时间为6-8小时；8)将步骤7)所得晶体用丙酮溶解，滴加纯化水，降温、析晶、分离得到潮晶；以g/mL计，潮晶与丙酮的重量体积比为1:4-5；和/或，所加入纯化水的量为丙酮体积的2.5-3倍；9)将所得潮晶真空减压干燥，即得到高纯度的多拉菌素结晶粉。可采用本领域常规方法获得多拉菌素发酵液。本专利技术还包括上述方法所制备的多拉菌素。进一步地，所述多拉菌素色谱纯度≥96.0％，含量≥94.0％；优选地，所述多拉菌素色谱纯度96.5％-98.1％，含量94.1％-96.0％。本专利技术和现有技术优势的对比，主要优点在于，通过两次逆流萃取，选择性的纯化了产品，并将多次结晶整合为2次结晶，其中一次结晶溶剂采用的是逆流萃取的溶剂，减少了溶剂的种类。其次所有需要浓缩的溶剂均为比较容易挥发溶剂，浓缩耗能少，溶剂能够重复利用。例如庚烷和二氯甲烷的混合物，可以根据两者沸点的绝大差异，很轻松的分离两相。丙酮水溶液也是非常容易回收的溶剂。工艺对减少污染物外排，及有机溶剂的再利用提供了较好的条件，更靠近国家对绿色环保工艺的倡导。此外得到多拉霉素成品的含量达到了94-96％的水平，纯度高。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。在本专利技术中，多拉霉素的含量是指：多拉霉素固体在进行高压液相检测后，根据标准品计算出纯的多拉菌素在被检测多拉菌素固体中(要扣除固体检测出的水份占有的重量，即无水重量)占有的百分含量。以下实施例中提到的含量均为此含义。高压液相上的纯度，仅仅表示在同一紫外条件下，多拉菌素在这堆有紫外吸收的物质中所占有的百分比。很多物质是没有紫外吸收的，或者杂质在紫外吸下收表现的含量和多拉菌素在实际的重量对比上没有任何参考。在以下实施例中均以色谱纯度表示。实施例1多拉菌素发酵液放罐，通过加入珍珠岩，压滤得到压滤菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高纯度多拉菌素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将多拉菌素发酵液过滤，得到菌渣；2)向所得菌渣中加入极性溶剂，萃取，过滤，得到滤液；3)调整步骤2)所得滤液中极性溶剂和水的浓度，使滤液中所述极性溶剂的浓度为70‑73％；过滤；4)将步骤3)所得滤液通过超滤膜进行超滤，得到超滤液；5)将步骤4)所得超滤液进入逆流萃取器与第一溶剂进行萃取交换；6)将步骤5)进行第一次逆流萃取交换后的超滤液再次进入逆流萃取器与第二溶剂进行萃取交换；7)将步骤6)所得萃取液浓缩到晶体析出，降温、养晶、过滤得到晶体；8)将步骤7)所得晶体用丙酮溶解，滴加纯化水，降温、析晶、分离得到潮晶；9)将所得潮晶真空减压干燥，即得到高纯度的多拉菌素结晶粉。

【技术特征摘要】
1.一种高纯度多拉菌素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将多拉菌素发酵液过滤，得到菌渣；2)向所得菌渣中加入极性溶剂，萃取，过滤，得到滤液；3)调整步骤2)所得滤液中极性溶剂和水的浓度，使滤液中所述极性溶剂的浓度为70-73％；过滤；4)将步骤3)所得滤液通过超滤膜进行超滤，得到超滤液；5)将步骤4)所得超滤液进入逆流萃取器与第一溶剂进行萃取交换；6)将步骤5)进行第一次逆流萃取交换后的超滤液再次进入逆流萃取器与第二溶剂进行萃取交换；7)将步骤6)所得萃取液浓缩到晶体析出，降温、养晶、过滤得到晶体；8)将步骤7)所得晶体用丙酮溶解，滴加纯化水，降温、析晶、分离得到潮晶；9)将所得潮晶真空减压干燥，即得到高纯度的多拉菌素结晶粉。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述极性溶剂选自甲醇、乙醇，优选为浓度75-80％甲醇溶液或乙醇溶液；优选地，步骤2)中，以g/mL计，菌渣干重与浓度75-80％甲醇溶液或乙醇溶液的重量体积比为1:5-7。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所用过滤介质的孔径≤0.22um；和/或，步骤4)所述超滤膜的孔径为6000-5000道尔顿。4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤5)所述第一溶剂选自甲苯、对二甲苯；优选地，步骤5)所述第一溶剂的用量为所述超滤液体积的1/3-1/2。5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤6)所述第二溶剂为正庚烷和二氯甲烷的混合液，其中正庚烷与二氯甲烷的体积比例为1:3-1:1；优选地，所述第二溶剂的用量为所述超滤液体积的1/4-1/2。6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤7)所述浓缩温度为40-45℃，和/或，结晶温度为10℃-20℃，和/或，养晶时间为6-8小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：何勇崴，张葵，
申请(专利权)人：北大方正集团有限公司，北大医药重庆大新药业股份有限公司，北大医疗产业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11