一种荧光探针及其制备方法和用途技术

一种荧光探针及其制备方法和用途，所述荧光探针为加成激活型探针，可用于蛋白的特异性荧光标记，还可用于蛋白的定量、检测、动力学、活性研究以及细胞、组织和活体影像。

【技术实现步骤摘要】
一种荧光探针及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种荧光探针及其制备方法和用途。
技术介绍
荧光特异性标记，是研究蛋白功能并定量的一种重要手段。和其它研究方法相比，荧光标记具有灵敏、原位、即时、可视等不可替代的优势。有机小分子荧光染料的分子结构虽然丰富，但是小分子荧光探针在蛋白特异性标记方面仍存在很多缺陷。无论游离的探针还是已标记的探针都存在同样的荧光发射，也就是说，不管标记上的还是没标记上的探针都在该体系内发射荧光。这种非特征性的荧光发射，显然是当前配体标记技术的严重缺陷。将没有标记上的探针通过洗涤的方法加以去除，是当前解决以上问题的唯一有效方法。显然，在一些需要快速，或者无法洗涤的场合，该技术的应用将受到严重限制。假若设计一种适用于配体标记技术的荧光激活型蛋白特异标记的方法，它在未标记之前是暗的或发射非常弱的荧光，一旦它标记在蛋白上后，染料的荧光急剧增强。毫无疑问，这类设计的探针将有可能实现与荧光蛋白具有等同的特异性，不仅可以免除游离探针洗涤，大幅降低游离探针的背景干扰，而且势必拓宽此类技术的应用。设计适用于该技术的荧光激活型蛋白特异标记的方法，必须考虑一个合适的荧光失/激活机制。FRET机制首先应用于这方面的设计，在配体上额外加入荧光淬灭基团，正常情况下小分子荧光被与之相连的基团淬灭；一旦配体与化学标签结合后淬灭基团离去，实现荧光激活(Z.X.Chenet.al.J.Am.Chem.Soc.2012，124，12692—12699.)。但是，淬灭基团的引入，大大增加了探针的分子体积，使标记速度大大下降，严重限制了探针在细胞、组织中蛋白的实时跟踪与检测，并且，荧光探针与淬灭基团之间必须具有较好的能级匹配，这样使得长波长，例如，红光发射染料的FRET设计非常困难。另外，一些荧光对极性敏感的染料也被用来设计激活型探针(T.K.Liu.et.al.ACSChem.Biol.2014，9，2359—2365.)，染料处于细胞液等大极性溶剂中，探针没有荧光或者具有较弱荧光，当配体与蛋白结合，探针处于蛋白非极性口袋中，探针发射较强荧光。然而，一方面由于蛋白表面本身就存在一个极性较大的水化层，使探针的荧光增强幅度有限；另一方面，细胞或组织本身是个非常复杂的体系，各个细胞器的极性变化很大，这些都会导致极性敏感的探针在细胞或组织造影中具有很高的背景。
技术实现思路
本专利技术人发现，通过将加成激活型荧光染料与配体部分相连，可以实现特异性标记靶蛋白，并实现荧光特异性点亮，探针荧光不受其他亲核试剂的影响，从而获得了一种全新结构的荧光探针，可用于蛋白的特异性标记，标记速度快、适用范围广，能够有效用于靶蛋白的标记、跟踪、定位和定量。本专利技术是通过以下技术方案来实施的：本专利技术提供一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括配体部分A、任选的连接体部分B、荧光染料部分C，所述荧光染料部分C为加成激活型荧光染料基团，包括荧光团D、任选的不饱和结构部分E、双键部分F，所述配体部分A包括能够与靶蛋白特异性识别的基团。可选地，上述的荧光探针，其具有如式(I)所示的结构，A-B-C(I)其中：配体部分A包括能够与靶蛋白特异性识别的配体基团、药物基团、小分子抑制剂基团或2-100个氨基酸组成的短肽类基团；连接体部分B为任选存在的基团，选自亚烷基、改性亚烷基、芳基、其中R选自氢、烷基、改性烷基或芳基。荧光染料部分C为式(I)中的式(I-a)所示结构部分，其中：双键部分F为式(I-a)中的式(I-a-1)所示结构部分，R1、R2、R3各自独立地选自氢、卤原子、硝基、氰基、羧基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基或改性烷基；可选地，R2和R3相互连接，与碳原子一起形成脂环或脂杂环；不饱和结构部分E为任选存在的基团，其为如下式(I-b)所示的结构，为选自亚乙烯基或共轭亚烯基、亚乙炔基或共轭亚炔基、亚芳基、亚杂芳基中的至少一种，且其与D环共轭连接，并且与式(I-a-1)共轭连接，其中不饱和结构部分E所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成脂环或脂杂环；荧光团D选自香豆素类基团、芘类基团、氟硼二吡咯甲川类(BODIPY)基团、呫吨类基团、花箐类基团、卟啉类基团。可选地，上述的荧光探针，其具有如式(I-I)所示的结构，可选地，R2与连接体部分B相互连接形成脂环或脂杂环；可选地，R2与配体部分A相互连接形成脂环或脂杂环；可选地，式(I-a-1)结构为如下所示：可选地，上述的荧光探针，其特征在于：所述靶蛋白为提纯品、未提纯品或存在于细胞、组织或活体的原位状态，所述靶蛋白具有亲核基团；可选地，所述靶蛋白为二氢叶酸还原酶或其突变体、His-tag(ShoheiUchinomiya.etal.Chem.Commun.,2013,49,5022—5024.)或其突变体、激酶或其突变体、组织蛋白酶(Cysteinecathepsins)或其突变体、碳酸酐酶或其突变体、FKBP12或其突变体；可选地，所述靶蛋白为突变的二氢叶酸还原酶L28C或W22C，或生长因子T790M；可选地，所述亲核基团选自：巯基、羟基、氨基、咪唑、吡咯；可选地，所述配体部分A选自甲氨基碟呤类基团、镍配体类基团、锌配体类基团、替尼类药物基团、短肽类基团、苯磺酰胺类基团、雷帕霉素类基团；所述镍配体类基团是指与镍形成配合物的基团，例如下式3、4所示基团；所述锌配体类基团是指与锌形成配合物的基团，例如下式5所示基团；可选地，所述配体部分A选自下式结构：可选地，所述连接体部分B选自：其中R选自氢、烷基、改性烷基或芳基。可选地，所述不饱和结构部分E选自下式(I-1)～(I-9)中的结构：可选地，所述香豆素类基团的结构如式(II-I)所示：其中，R6-为X0O-或N(X1)(X2)-，X0、X1、X2各自独立地选自氢、烷基和改性烷基，可选地，X1，X2相互连接为饱和或不饱和的脂杂环；可选地，所述香豆素类基团中下式(II-I-i)所示的母核结构中，所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环；可选地，式(II-I-i)上的取代基与X0、X1或X2相互连接形成饱和或不饱和脂杂环；所述芘类基团的结构如式(II-II)所示，其中所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环；可选地，所述氟硼二吡咯甲川类基团的结构如式(II-III)所示，其中，R7、R8各自独立地选自卤原子、烷基、改性烷基；其中，式(II-III)所示氟硼二吡咯甲川类基团中的下式(II-III-i)所示母核结构中，所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；可选地，所述呫吨类基团的结构如式(II-IV-a)、(II-IV-b)、(II-IV-c)或(II-IV-d)所示，其中：X3、X4、X5、X6、X7各自独立地选自氢、烷基、改性烷基；X4、X5、X本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括配体部分A、任选的连接体部分B、荧光染料部分C，所述荧光染料部分C为加成激活型荧光染料基团，包括荧光团D、任选的不饱和结构部分E、双键部分F，所述配体部分A包括能够与靶蛋白特异性识别的基团。

【技术特征摘要】
1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括配体部分A、任选的连接体部分B、荧光染料部分C，所述荧光染料部分C为加成激活型荧光染料基团，包括荧光团D、任选的不饱和结构部分E、双键部分F，所述配体部分A包括能够与靶蛋白特异性识别的基团。2.根据权利要求1所述的荧光探针，其具有如式(I)所示的结构，A-B-C(I)其中：配体部分A包括能够与靶蛋白特异性识别的配体基团、药物基团、小分子抑制剂基团或2-100个氨基酸组成的短肽类基团；连接体部分B为任选存在的基团，选自亚烷基、改性亚烷基、芳基、其中R选自氢、烷基、改性烷基或芳基。荧光染料部分C为式(I)中的式(I-a)所示结构部分，其中：双键部分F为式(I-a)中的式(I-a-1)所示结构部分，R1、R2、R3各自独立地选自氢、卤原子、硝基、氰基、羧基、酮基、酯基、酰胺基、膦酸基、膦酸酯基、磺酸基、磺酸酯基、砜基、亚砜基、芳基、杂芳基、烷基、改性烷基、亚烷基或改性亚烷基；可选地，R2和R3相互连接，与碳原子一起形成脂环或脂杂环；不饱和结构部分E为任选存在的基团，其为如下式(I-b)所示的结构，为选自亚乙烯基或共轭亚烯基、亚乙炔基或共轭亚炔基、亚芳基、亚杂芳基中的至少一种，且其与D环共轭连接，并且与式(I-a-1)共轭连接，其中不饱和结构部分E所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成脂环或脂杂环；荧光团D选自香豆素类基团、芘类基团、氟硼二吡咯甲川类基团、呫吨类基团、花箐类基团、卟啉类基团；可选地，上述的荧光探针，其具有如式(I-I)所示的结构，可选地，R2与连接体部分B相互连接形成脂环或脂杂环；可选地，R2与配体部分A相互连接形成脂环或脂杂环；可选地，式(I-a-1)结构为如下所示：3.根据权利要求1或2所述的荧光探针，其特征在于：所述靶蛋白为提纯品、未提纯品或存在于细胞、组织或活体的原位状态，所述靶蛋白具有亲核基团；可选地，所述靶蛋白为二氢叶酸还原酶或其突变体、His-tag或其突变体、激酶或其突变体、组织蛋白酶(Cysteinecathepsins)或其突变体、碳酸酐酶或其突变体、FKBP12或其突变体；可选地，所述靶蛋白为突变的二氢叶酸还原酶L28C或W22C，或生长因子T790M；可选地，所述亲核基团选自：巯基、羟基、氨基、咪唑基、吡咯基；可选地，所述配体部分A选自甲氨基碟呤类基团、镍配体类基团、锌配体类基团、替尼类药物基团、短肽类基团、苯磺酰胺类基团、雷帕霉素类基团；可选地，所述配体部分A选自下式结构：可选地，所述连接体部分B选自：其中R选自氢、烷基、改性烷基或芳基。可选地，所述不饱和结构部分E选自下式(I-1)～(I-9)中的结构：可选地，所述香豆素类基团的结构如式(II-I)所示：其中，R6-为X0O-或N(X1)(X2)-，X0、X1、X2各自独立地选自氢、烷基和改性烷基，可选地，X1，X2相互连接为饱和或不饱和的脂杂环；可选地，所述香豆素类基团中下式(II-I-i)所示的母核结构中，所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环；可选地，式(II-I-i)上的取代基与X0、X1或X2相互连接形成饱和或不饱和脂杂环；所述芘类基团的结构如式(II-II)所示，其中所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、硝基、亲水性基团、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环；可选地，所述氟硼二吡咯甲川类基团的结构如式(II-III)所示，其中，R7、R8各自独立地选自卤原子、烷基、改性烷基；其中，式(II-III)所示氟硼二吡咯甲川类基团中的下式(II-III-i)所示母核结构中，所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；可选地，所述呫吨类基团的结构如式(II-IV-a)、(II-IV-b)、(II-IV-c)或(II-IV-d)所示，其中：X3、X4、X5、X6、X7各自独立地选自氢、烷基、改性烷基；X4、X5、X6、X7任选相互连接为饱和或不饱和的脂杂环；L为阴离子；X选自O、CRaRb、SiRaRb、GeRaRb、SnRaRb、Se，其中Ra、Rb各自独立地选自氢、烷基和改性烷基，可选地，Ra、Rb相互连接为脂环或脂杂环；其中，所述呫吨类基团中的下式(II-IV-i)所示母核结构中，所含的各氢原子任选独立地被选自卤原子、烷基和改性烷基的取代基取代，所述取代基任选地相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；可选地，式(II-IV-i)上的取代基与X4、X5、X6、X7相互连接构成饱和或不饱和的脂环或脂杂环、芳香环或芳香杂环；可选地，所述花箐类基团的结构如式(II-V-a)、(II-V-b)、(II-V-c)、(II-V-d)、(II-V-e)或(II-V-f)所示，其中：X、Y各自独立地选自S、O、CRcRd，其中Rc、Rd各自独立地选自氢、烷基、改性烷基；X8、X9各自独立地选自氢、烷基、改性烷基；L为阴离子；其中，所述花箐类基团中的如下式(II-V-i)、(II-V-ii)或(II-V-iii)所示的母核结构中，所含的个氢原子任选独立地被选自亲...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱麟勇，杨弋，张大生，刘韧玫，鲍丙坤，林秋宁，陈显军，杨立朋，包春燕，葛一会，张晨霞，陈政达，张思铜，李宁峰，华鑫，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31