甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用，该疫苗载体以两亲性三嵌段共聚物为材料，亲水内腔中载入OVA，IMQ载入疏水的膜层，DOTAP阳离子层嵌合MPLA，阳离子脂质外层吸附外层OVA；并引入具有活性基团的磷脂，将具有靶向作用的甘露糖配体通过共价键连接载聚合物囊泡表面PEG活性远端，集主动靶向肿瘤、共递送抗原和佐剂等功能于一体；具有粒径小、分散性好、抗原载药量高和良好生物相容性等特点，可促进抗原的摄取、DC的活化与成熟、抗原的交叉提呈、抗原的淋巴结迁移、淋巴细胞的活化、效应性T细胞的免疫反应、CD8

【技术实现步骤摘要】
甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物医学工程
，具体涉及一种甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用。
技术介绍
恶性肿瘤目前严重威胁人类健康，总体治愈率低于20％。目前临床上针对肿瘤的治疗方法主要包括手术切除、化疗和放疗。这些治疗手段往往聚焦于肿瘤局部病灶，都存在局限性，手术切除对发生转移的肿瘤治疗无效；化疗和放疗毒副作用大，严重损伤病人的免疫系统。肿瘤的治疗经历了传统治疗到靶向治疗，再到最新的细胞免疫治疗。肿瘤的免疫治疗已经成为“第四大”被证明能显著提高临床治疗效果的肿瘤治疗方法，是未来3-5年疾病治疗领域的热点，也是目前全球研究的热点，肿瘤的免疫治疗将会颠覆肿瘤治疗格局。通过增强机体的免疫系统(体液免疫和细胞免疫)，改变肿瘤生长的微环境抑制肿瘤生长，从而控制和杀灭肿瘤。给转移性晚期肿瘤患者带来福音，并被认为是目前唯一可能彻底治愈癌症的治疗手段。目前肿瘤免疫治疗主要3个方面着手：①作用于DC细胞抗原提呈阶段的DC治疗性肿瘤疫苗；②作用于T细胞活化效应阶段的T细胞过继疗法；③作用于免疫检查点信号传导的免疫检查点抑制剂。其中，DC治疗性肿瘤疫苗发展火热，制备DC疫苗主要分为两种方法，一种方法是体内抗原靶向DC，将抗原和佐剂与细胞表面受体配基如甘露糖或趋化因子等制成疫苗直接靶向体内DC，从而增强DC摄取抗原的能力；另一种方法是让DC在体外荷载抗原和佐剂后回输到患者体内，产生保护性免疫反应，两种方法的最终目的都是活化抗原特异性CD4+和CD8+T细胞，最大程度发挥抗肿瘤效应。后者已经在肿瘤免疫治疗的临床研究中取得突破性进展，成为肿瘤免疫治疗的研究热点。DC疫苗安全性高，能够有效激发抗肿瘤免疫反应而无严重的毒副作用。研究表明，甘露糖受体(MR)属于DC细胞和巨噬细胞膜表面受体，是C2型动物凝集素超家族之一，可以识别末端为甘露糖、海藻糖和N-乙酰葡萄糖胺的糖链，介导有效的抗原识别与摄取。未成熟的DC细胞表面高表达MR，因此甘露糖修饰对DC细胞具有特异的靶向性，从而提高对DC细胞的摄取和提呈效率。靶向肿瘤的多肽及蛋白疫苗被认为能活化CD4+T及CD8+T细胞，但是此类疫苗不能产生足够的免疫应答强度从而限制了其抗肿瘤效率。目前，用TLR配体对多肽疫苗产生佐剂效应成为该领域的研究热点。已有研究表明，TLR配体如TLR3配体、TLR4配体、TLR7/8配体和TLR9配体可以作为佐剂与多肽疫苗联用能够提高APC及NK细胞的活性，促进肿瘤的死亡。多种TLR配体可作用于DC，直接或间接促进DC的成熟和迁移，提高DC诱导的免疫应答。TLRs是宿主对抗病原体的第一道屏障。TLR7主要表达于抗原提呈细胞如浆细胞样DC，TLR8大部分表达于髓系细胞如髓系DC，可以诱导有效的Th1极化反应。TLRs家族信号机制的特征之一是利用胞质区的街头蛋白分子和激酶传导信号。胞内的TLR7/8与其对应的配体结合后，募集包含髓样分化蛋白88(MyD88)的TIR结构域。MyD88与TLR7/8协同作用负责IL-1受体相关激酶家族成员的招募，活化了下游有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPKs)和IκB激酶(IKK)复合体。MAPKs通过磷酸化激活了转录因子激活蛋白(AP)-1。IKK复合体负责核转录因子(NF-κB)的核转录。AP-1和NF-κB协同控制促炎性细胞因子基因的表达。Toll样受体8激动剂合成的非核苷类异环咪唑喹琳胺类如咪喹莫特(R-837)、瑞喹莫德(R-848)、S-27609和鸟苷类似物(洛索立宾)等，通过TLR咪喹莫特和瑞喹莫德激活NF-κB。目前，咪喹莫特被认为无直接杀伤病毒和肿瘤的能力，主要通过免疫调节机制，与树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞等的TLR7结合，诱导IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ等多种Th1型细胞因子的分泌，激活机体的天然免疫反应和获得性免疫反应。已有研究发现，如果将TLR7/8激动剂和TLR4激动剂联合使用，DCs会表现出更强的Th1极化作用。囊泡(vesicle)是一种由两亲性分子自组装形成的具有类细胞膜双层结构的球形、椭球形或扁球形有序超分子聚集体。一般由合成表面活性剂自组装形成囊泡，由天然磷脂则成为脂质体。1999年，Discher等报道了经两亲性嵌段共聚物(PEG40-PEE37)通过自组装形成囊泡，被称为聚合物囊泡(Polymersomes)。这种巨大囊泡被证明其硬度比磷脂大，在裂解前能维持很大张力，对水的渗透性比普通的磷脂双层膜小。后来人们用聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)制备了多种可控释的聚合物囊泡。由天然改性或合成的两亲性聚合物自组装成的聚合物囊泡相对于表面活性剂和脂质体等小分子囊泡，具有强度高、渗透性强、稳定性好和分子可设计性好等优点。聚合物囊泡有其独特的优势，主要包括：①具有亲水内腔和疏水双分子膜层，可以增溶水溶性成分(如蛋白质、多肽、DNA和RNA片段)、脂溶性药物(如紫杉醇)或同时递送水溶性和脂溶性药物。②聚合物囊泡具有与生物膜类似的双层膜结构，可以与生物屏障很好地兼容，是药物递送的优良载体。囊泡的双层膜结构可以延缓所载活性分子的释放，同时囊泡的亲水外壳延长了体内循环时间，提高了药物的体内生物利用度。③聚合物囊泡粒径一般在几百纳米左右，并且其表面亲水外壳具有空间稳定性，在体内具有长循环特性，可以利用利用肿瘤组织的EPR效应，避免了RES的吞噬，在病变部位积累，获得被动靶向效果。EPR的被动靶向使聚合物囊泡选择性富集在肿瘤组织，不仅提高了疗效，而且降低了毒副租用。④聚合物囊泡表面可以通过亲水链段稳定连接特异性配体，如叶酸、抗体和甘露糖等，从而增强其血液长循环特性并赋予囊泡主动靶向功能。⑤聚合物有优良的分子可设计性，选择不同的分子量、嵌段比例或共聚物结构的两亲性聚合物分子可以构建不同粒径、膜厚、渗透性和载药量的聚合物囊泡系统。近年来，作为一种软纳米材料的聚合物囊泡随着大分子自组装技术的发展，已经成为一种新型药物载体，吸引了研究者的广泛关注。聚合物囊泡重要的应用之一就是作为药物(包括小分子抗肿瘤药物、蛋白质和基因)的载体。与其他载体相比，聚合物囊泡更适合用来包载蛋白质。与脂质体比，聚合物囊泡壁膜的稳定性更高，可以更好保护蛋白质不被降解，并且具有较高的载药量。Li等用功能化的PEG-PTMC制备出新型可降解的具有离子化膜的聚合物囊泡，高效包载蛋白并实现胞内快速释放，在胞内蛋白递送载体方面具有潜力。聚合物囊泡在DC疫苗中发挥重要作用，近红外荧光发射聚合物囊泡可以用来标记体外细胞和追踪体内细胞，利用活体成像技术示踪体内DC来了解对肿瘤治疗的意义。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术目的在于提供一种甘露糖修饰的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡及其制备方法与应用，该疫苗载体将模式抗原有效包载在聚合物囊泡的亲水内腔中，将TLR7/8激动剂IMQ包载在疏水膜层，TLR4激动剂MPLA嵌聚合物囊泡表面的阳离子脂质中，通过静电作用将OVA吸附在聚合物囊泡外层，靶向基团通过DSPE-PEG-NH2连接在囊泡的外壳，粒径较小(<300本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，包括步骤：S1：将两亲性三嵌段共聚物PCL‑b‑PEG‑b‑PCL和免疫激动剂溶于有机溶剂中；然后在冰浴条件下超声，在超声过程中滴入抗原溶液，得到初级乳化液；S2：将所述初级乳化液滴入聚乙烯醇溶液中，然后用水清洗；将清洗后的混合物在冰浴条件下超声，得到二级乳化液；S3：去除所述二级乳化液中的有机溶剂，然后离心，收集沉淀；S4：将阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成均匀薄膜；将所述沉淀用水和/或PBS溶液重悬，然后加至所述薄膜中进行水化；S5：将所述水化后的混合物震荡混匀，然后在冰浴条件下超声，将超声后的混合物和抗原溶液混合后孵育，得到共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡。

【技术特征摘要】
1.一种共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，包括步骤：S1：将两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和免疫激动剂溶于有机溶剂中；然后在冰浴条件下超声，在超声过程中滴入抗原溶液，得到初级乳化液；S2：将所述初级乳化液滴入聚乙烯醇溶液中，然后用水清洗；将清洗后的混合物在冰浴条件下超声，得到二级乳化液；S3：去除所述二级乳化液中的有机溶剂，然后离心，收集沉淀；S4：将阳离子磷脂DOTAP和免疫激动剂溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成均匀薄膜；将所述沉淀用水和/或PBS溶液重悬，然后加至所述薄膜中进行水化；S5：将所述水化后的混合物震荡混匀，然后在冰浴条件下超声，将超声后的混合物和抗原溶液混合后孵育，得到共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡。2.根据权利要求1所述的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：S4中，还包括将功能磷脂溶于有机溶剂的步骤；并且S5中，将超声后的混合物和抗原溶液混合前还包括步骤：在超声后的混合物中加入糖类结构，然后加入三乙胺，搅拌反应预设时间。3.根据权利要求2所述的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：所述功能磷脂为DSPE-PEG-NH2和/或DSPE-PEG-Mal；所述DSPE-PEG-NH2的PEG分子量为2000；所述糖类结构选自异硫氢酸苯基-α-D-甘露糖苷、半乳糖、岩藻糖、葡聚糖和N-乙酰葡萄糖胺中的一种或多种的混合物；所述功能磷脂和所述糖类结构的摩尔比为1:1，所述三乙胺的体积和所述糖类结构的质量的比值为1μL:0.05mg；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和所述糖类结构的质量比为20mg:0.05mg；所述搅拌反应的时间为2-4h。4.根据权利要求1所述的共载抗原和双免疫激动剂磷脂杂化聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：S1中，所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL和所述免疫激动剂的质量比为20mg:2mg；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的分子量为10000-24000，优选为16000，其中PEG亲水链段质量百分数大于45％；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL优选为PCL4000-PEG8000-PCL4000；所述免疫激动剂为TLR4、TLR7/8、TLR1、TLR2、TLR5、TLR6、TLR3和TLR9中的一种或多种；优选地，TLR7/8激动剂为IMQ和/或R848，TLR4激动剂为MPLA；所述有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；所述两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL的质量和所述有机溶剂的体积的比值为20m...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琳华，朱敦皖，胡春艳，樊帆，张志明，
申请(专利权)人：中国医学科学院生物医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12