一种斑马鱼FL肿瘤模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术属于医学生物技术领域，具体涉及一种斑马鱼FL肿瘤模型的构建方法及其应用。本发明专利技术经过研究首次以斑马鱼作为模式生物成功构建了FL人源肿瘤异种移植模型。实验操作简便可行，实验周期短，消耗肿瘤细胞极少，可重复性高，可广泛应用于分子生物学研究及靶向药物筛选等多种领域。

【技术实现步骤摘要】
一种斑马鱼FL肿瘤模型的构建方法及其应用
本专利技术属于医学生物
，具体涉及一种斑马鱼FL肿瘤模型的构建方法及其应用。
技术介绍
滤泡性淋巴瘤(FL)是惰性非霍奇金淋巴瘤(NHL)最常见的类型，占NHL的FL的发病与GC反应密切相关。众所周知，FL的标志性突变为t(14；18)(q32；q21)(约占85％)，之后携带t(14；18)(q32；q21)突变的B细胞随3环来到GC，在GC中携带t(14；18)的B细胞可以像正常B细胞一样在滤泡辅助性T细胞(Tfh)增殖发育。T(14；18)易位将BCL2基因置于IgH调控元件之下，由于属于抗凋亡家族的BCL2的异位表达，使这些B细胞具有生存优势。正常情况下，GC中由BCL6抑制B细胞的凋亡，BCL2不表达。由于BCL2的异常的抗凋亡作用，t(14；18)的B细胞逃避机体的凋亡机制，与外来抗原结合。当携带t(14；18)的B细胞在体内循环时，由于其他遗传学变化而转化为恶性肿瘤。这是FL最常见的发展模式。除上述典型的t(14；18)(q32；q21)易位外，几乎所有病例在初次诊断时均显示其他继发性染色体改变。常见的染色体异常包括染色体2，5，7，8，12，18，21和X的重复，1q，6P，9q和17q等整条染色体臂的重复，以及6q和17P的缺失。通常还可观察到一些小片段异常，包括1p36.31-p36.33、6q13-q15、6q23.3-q24.1、6q23.2-q25和10q23.1-q25.1的缺失，以及2p16.1-p15、8q24.13-q24.3和12q12-q13重复等。表观遗传学方面，几乎所有FL都存在表观遗传学调节因子异常，主要包括KMT2D，EZH2，CREBBP，EP300和MEF2B、SWI/SNF核小体成员重塑复合物ARID1A、ARID1B和BCL7A，以及链接组蛋白H1家族(HIST1H1B，C，D，E)和其他组蛋白基因(包括HIST1H2BK，HIST1H3G，HIST1H2AC)等。几乎80％的病例具有多重表观遗传学突变。除多种遗传学的异常，FL在疾病的发展历程，每年约2％-3％的概率向高级的淋巴瘤转化，最常转化为弥漫大B细胞淋巴瘤，目前已报道许多基因水平的变化与转化有关，包括2q、6p、7p、12q和17q的重复，5p和8q的缺失，C-MYC重组、p53突变，BCL-6积累突变，体细胞突变中的BCL2基因易位和p16、p15失活等。然而，上述研究均为基于患者临床标本的基因组学研究结果，FL致病分子机制尚未阐明。尽管FL的临床表现为惰性的病程，对化疗或免疫化疗方案敏感，但即使在利妥昔单抗时代，FL仍难获得治愈。在肿瘤向慢病治疗的理念下，如何选择个体化的最优治疗策略，对于延长患者生存，提高生活质量具有深远的意义。动物肿瘤模型主要用于分子生物学(包括致病机制研究、治疗靶点新药筛选)研究。人类疾病十分复杂，临床积累的经验在时间和空间上都存在局限性，以人作为实验对象来研究疾病发生机制存在许多伦理和方法上的限制。动物肿瘤模型极大地促进了肿瘤分子生物学研究的进展：1.动物模型与人类具有较高的同源性，且繁殖速度快、样本数目多，可复制性高，实验结果可与人类疾病进行比较研究，快捷有效地认识人类疾病的发生发展规律；2.动物模型可以特异性的进行遗传学修饰，严格控制实验条件，增强实验结果的科学性和可比较性，有助于全面认识疾病的本质；3.动物模型可改变自然条件下不可能或不易改变的因素，尤其在潜伏期长、病程长和发病率低的疾病研究中具有极大的应用价值。人源肿瘤异种移植模型(patient-derivedxenograftmodel，PDX模型)是指将患者的肿瘤组织取下后，接种在免疫缺陷的动物(目前主要是小鼠)体内，小鼠成瘤以后进一步传代以待后续研究。构建的肿瘤模型既保留了肿瘤患者的组织学和遗传学特征，又维持了肿瘤的异质性。PDX模型能帮助科学家更好地研究肿瘤异质性和遗传复杂性，更深入探究肿瘤发生机制及发现潜在治疗靶点，还可以帮助预测患者对治疗药物可能产生的反应，包括疗效、毒副作用、吸收程度等，因此被广泛的应用到肿瘤药物研发当中。相比传统肿瘤细胞异种移植动物模型，应用PDX模型进行一些治疗方法临床应用潜力的评估会更加精确，它能提供更好的临床前药物疗效测试及分析。近年来，随着肿瘤精准医学概念的提出，对PDX小鼠模型的需求和利用正日益扩大，尤其是借助于PDX小鼠模型进行肿瘤有效药物的筛选和评估，并逐步将其应用于临床上指导肿瘤患者的个体化治疗。PDX模型结合临床数据、基因组图谱以及药效数据可以增加药物特异性，应用于肿瘤患者个体化治疗，提高临床治疗成功率。斑马鱼(Zebrafish，Daniorerio)是一种国际性的生物医学研究模式生物，具有以下特点：1.成鱼体积小，仅3-4cm；繁殖周期短，仅3个月；养殖成本低。产卵量大可用于大规模研究；2.鱼卵和胚胎自身具有胚胎学和遗传学的突出特征。发育早期3-7天呈透明样，便于观察，免疫系统成熟较晚，便于成瘤；3.斑马鱼生物信息，如全基因组测序信息等完善。因此，利用斑马鱼作为人类疾病的动物模型，其独特的生物学、基因组学、遗传学优势及其高度保守的疾病信号通路，使其成为以表型驱动的“正向”及“反向”遗传学(ForwardandReverseGenetics)研究，及活体内先导药物筛选研究的最佳模式生物之一。斑马鱼作为新型的模式生物，与细胞和小鼠相比，具有高通量、短周期和易操作等优势。然而，斑马鱼人源肿瘤异种移植模型(Zebrafishpatient-derivedxenograftmodel,zPDX模型)的构建及相关分子生物学研究尚处于起步阶段。关于FL的动物模型,人源斑马鱼肿瘤模型领域的研究仍是一片空白。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种斑马鱼FL肿瘤模型的构建方法及其应用。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种斑马鱼FL肿瘤模型的构建方法，包括如下步骤：将人源FL细胞注射到斑马鱼胚胎中，培养成瘤。本专利技术中，所述FL是指滤泡性淋巴瘤(follicularlymphoma)。进一步地，所述方法中，所述斑马鱼胚胎是生长了48个小时的斑马鱼胚胎。进一步地，所述方法中，是将人源FL细胞注射到斑马鱼胚胎的卵黄囊中。进一步地，所述方法中，所述人源FL细胞为人源原代FL细胞。进一步地，所述方法中，所述人源FL细胞为FL患者术后取得或FL患者活检取得。进一步地，所述方法中，所述人源FL细胞为进行了标记的人源FL细胞。再进一步地，所述方法中，所述人源FL细胞进行了染色标记的人源FL细胞。再进一步地，所述方法中，所述人源FL细胞进行了荧光染色标记的人源FL细胞。例如，可采用Dil染料进行染色。进一步地，所述方法中，取斑马鱼胚胎，人工破膜麻醉后置于显微注射板上，然后将人源FL细胞加入显微注射针中，显微镜下操作将所述人源FL细胞注射到斑马鱼胚胎中。本专利技术的第二方面，提供了前述斑马鱼FL肿瘤模型的构建方法用于FL治疗药物筛选的用途。本专利技术的第三方面，提供一种筛选FL治疗药物的方法，包括步骤：将备选物质施用于前述构建方法构建获得的斑马鱼FL肿瘤模型，若能抑本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑马鱼FL肿瘤模型的构建方法，包括如下步骤：将人源FL细胞注射到斑马鱼胚胎中，培养成瘤。

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼FL肿瘤模型的构建方法，包括如下步骤：将人源FL细胞注射到斑马鱼胚胎中，培养成瘤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述斑马鱼胚胎是生长了48个小时的斑马鱼胚胎。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，是将人源FL细胞注射到斑马鱼胚胎的卵黄囊中。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述人源FL细胞为人源原代FL细胞。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述人源FL细胞为进行了标记的人源FL细胞。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述人源FL细胞进行了染色标记的人...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵维莅，王楠，孙晓建，王黎，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：上海,31