一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法技术

本发明专利技术属于植物组织培养技术领域，公开了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，所述方法利用一定浓度的秋水仙素溶液浸泡株高为15～25cm的水培法培养的再生植株根部，然后继续水培再生植株至移栽大田。水培后的所述再生植株粗壮，根系发达，根部活力强，用秋水仙素溶液浸根处理时，根系能充分均匀吸收秋水仙素成分，加倍效果好。本发明专利技术的培养方法，无需挖苗、洗根，全程无根系损伤，提高了再生植株的成活率，操作简单易行，易于实施，成本低，便于大规模生产应用。

【技术实现步骤摘要】
一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法
本专利技术属于植物组织培养
，涉及一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法。
技术介绍
我国是世界油料消费大国，国产食用植物油供给长期严重不足，进口压力居高不下，安全隐患日益凸现。油菜籽油是国产食用植物油的第一大来源，占国内油料作物产油量的50％以上，因此，油菜种业的稳定健康发展，是我国植物油供给安全的重要保障。油菜种业的高产优质发展离不开优良品种的支撑，在油菜新品种的研究及开发中，小孢子培养技术发挥着至关重要的作用，能快速纯合各种优良性状，加快育种进程，是油菜育种的重要途径。一般而言，在植物界由小孢子形成的再生植株群体中，仅有极少数可自然加倍形成双单倍体植株，绝大多数单倍体植株(Haploidplants，简称H植株)不能自然加倍成为双单倍体植株(Doublehaploidplants，简称DH株)，使其不能正常开花结籽和配制杂交种，达不到育种的需求。因此，研究单倍体植株如何高频率二倍化成为小孢子培养技术在油菜遗传和育种中成功应用的重要技术问题。现有技术中，油菜离体小孢子单倍体再生植株的加倍方法主要有三种：(1)秋水仙素处理离体小孢子；(2)秋水仙素处理小孢子再生植株的顶芽、腋芽；(3)秋水仙素浸泡小孢子再生植株的根部。这三种方式中，秋水仙素的浸根加倍法加倍率最高，但传统浸根加倍法需要先将单倍体植株从土壤中挖出来，洗净根部泥土后用一定浓度的秋水仙素溶液浸根2～6h，然后再用清水冲洗根部后移栽土壤中，操作繁琐，尤其是大规模处理时，挖苗、洗根、移栽等工作量非常庞大；其次，挖苗及移栽过程中，容易损伤根系，进而会对植株的生长带来十分不利的影响。
技术实现思路
因此，本专利技术旨在提供一种易于操作、成本低且加倍率高的油菜离体小孢子再生植株的培养方法。为此，本专利技术提供了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，包括如下步骤：(1)水培小孢子组培苗，得到株高为15～25cm的再生植株；(2)用秋水仙素溶液对步骤(1)中的所述再生植株进行浸根处理；(3)继续水培步骤(2)中的所述组培苗至移栽大田。进一步地，所述水培的营养液为改良的霍格兰溶液，其配方为：5mmol/LKNO3；5mmol/LCa(NO3)2·4H2O；1mmol/LKH2PO4；2mol/LMgSO4·7H2O；46μmol/LH3BO3；0.77μmol/LZnSO4·7H2O；0.05mmol/LEDTA-Fe；0.37μmol/LNaMoO4·2H2O；0.32μmol/LCuSO4·5H2O；9.14μmol/LMnCl2·4H2O；所述营养液的pH为5.5～6.0。进一步地，所述营养液每14～16天更换一次。进一步地，所述水培在温度22～28℃、光照时间14～18h/d及光照强度4000～6000lx下进行。进一步地，所述秋水仙素溶液的浓度为0.2～0.35wt％。进一步地，所述浸根处理的时间为10～14h。进一步地，所述小孢子组培苗的获得包括如下步骤：(1)离体小孢子的制备：选取开花3～7天的油菜植株作为供体植株，从所述供体植株的主花序或一次分枝花序上取花蕾并灭菌，在灭菌后的花蕾中加入浓度为10～15wt％的蔗糖溶液，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液即得所述离体小孢子；(2)离体小孢子的培养：将步骤(1)中的所述离体小孢子移至NLN液体培养基中，于28～32℃下暗培养至肉眼可见胚状体，再在黑暗条件中于22～28℃下摇动培养至形成子叶形胚状体；(3)子叶形胚状体的培养：将步骤(2)中的所述子叶形胚状体移至固体B5培养基中，在温度22～28℃、光照时间15～18h/d及光照强度4000～6000lx下培养，3～4周继代培养至形成不定芽苗，即得所述小孢子组培苗。本专利技术的技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的油菜离体小孢子再生植株的培养方法，利用一定浓度的秋水仙素溶液浸泡株高为15～25cm的水培法培养的再生植株根部，然后继续水培再生植株至移栽大田，水培后的所述再生植株粗壮，根系发达，根部活力强，用秋水仙素溶液浸根处理时，根系能充分均匀吸收秋水仙素成分，加倍效果好。本专利技术的培养方法，无需挖苗、洗根，全程无根系损伤，提高了再生植株的成活率，操作简单易行，易于实施，成本低，便于大规模生产应用。2.本专利技术提供的油菜离体小孢子再生植株的培养方法，所述水培营养液为改良的霍格兰溶液，其含有油菜生长发育所需的各类营养成分，有利于培养出具有发达根系的健壮植株，提高了植株对秋水仙素的吸收。3.本专利技术提供的油菜离体小孢子再生植株的培养方法，选用特定浓度的秋水仙素溶液，既避免了高浓度的秋水仙素溶液妨碍植株生长，又避免了低浓度的秋水仙素溶液加倍效果不佳的缺陷。具体实施方式下面将对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。此外，下面所描述的本专利技术不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。实施例1本实施例1提供了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，包括如下步骤：(1)离体小孢子的制备在油菜初花期(开花3～7天)，从田间选取生长健壮的植株作为供体植株，在其主花序或一次分枝花序上取2.5～3.5mm的花蕾备用。花蕾的发育时期可能会有稍许不同，可以剥开花蕾挑取小孢子进行镜检以确定发育时期，最佳时期为单核晚期至双核早期。用浓度为0.2wt％的次氯酸钠溶液灭菌处理花蕾表面15min，再用无菌水冲洗3次。将消毒过的花蕾置于50mL离心管中，加入5mL浓度为13wt％的蔗糖溶液，用灭菌玻璃棒将花蕾研碎，压出花粉小孢子，并经800目无菌尼龙网过滤到另一个50mL离心管中，1100rpm、离心5min，并重复2次，将离心管中的上层清液吸去，即得离体小孢子。(2)离体小孢子的培养将步骤(1)中所得的离体小孢子用NLN液体培养基稀释至10mL，并分装在培养皿中。30℃下暗培养至肉眼可见胚状体，再在25℃、黑暗条件中移至50rpm恒温摇床上进行摇动培养至形成子叶形胚状体。(3)子叶形胚状体的培养将步骤(2)中所得的子叶形胚状体移至固体B5培养基中，在25℃、光照时间16h/d及光照强度4000～6000lx下培养，25d后继代培养一次至形成不定芽苗，即得小孢子组培苗。(4)水培育苗：将步骤(3)中所得的小孢子组培苗移栽到装有营养液的水培育苗盆中，于25℃、光照时间16h/d及光照强度4000～6000lx下进行水培育苗，每15天更换一次营养液，得到株高为21～25cm的再生植株。其中，水培营养液为改良的霍格兰溶液，其配方为：5mmol/LKNO3；5mmol/LCa(NO3)2·4H2O；1mmol/LKH2PO4；2mol/LMgSO4·7H2O；46μmol/LH3BO3；0.77μmol/LZnSO4·7H2O；0.05mmol/LEDTA-Fe；0.37μmol/LNaMoO4·2H2O；0.32μmol/LCuSO4·5H2O；9.14μmol/LMnCl2·4H2O；pH为5.8。(5)浸根加倍处理将步骤(3)所得的再生植株转移至浓度为0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，包括如下步骤：(1)水培小孢子组培苗，得到株高为15～25m的再生植株；(2)用秋水仙素溶液对步骤(1)中的所述再生植株进行浸根处理；(3)继续水培步骤(2)中的所述再生植株至移栽大田。

【技术特征摘要】
1.一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，包括如下步骤：(1)水培小孢子组培苗，得到株高为15～25m的再生植株；(2)用秋水仙素溶液对步骤(1)中的所述再生植株进行浸根处理；(3)继续水培步骤(2)中的所述再生植株至移栽大田。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述水培的营养液为改良的霍格兰溶液，其配方为：5mmol/LKNO3；5mmol/LCa(NO3)2·4H2O；1mmol/LKH2PO4；2mol/LMgSO4·7H2O；46μmol/LH3BO3；0.77μmol/LZnSO4·7H2O；0.05mmol/LEDTA-Fe；0.37μmol/LNaMoO4·2H2O；0.32μmol/LCuSO4·5H2O；9.14μmol/LMnCl2·4H2O；所述营养液的pH为5.5～6.0。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述营养液每14～16天更换一次。4.根据权利要求1-3任一项所述的培养方法，其特征在于，所述水培在温度22～28℃、光照时间14～18h/d及光照强度4000～60...

【专利技术属性】
技术研发人员：李书宇，陈伦林，丁戈，熊洁，邹小云，宋来强，
申请(专利权)人：江西省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36