本发明专利技术涉及生物检测技术领域，旨在提供一种鸡传染性支气管炎病毒QX型毒株鉴别检测试剂盒。该试剂盒包括两对引物，分别是用于扩增传染性支气管炎病毒的通用引物和用于特异性扩增QX基因型毒株的引物；其中，用于特异性扩增QX基因型毒株的引物的序列如如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本发明专利技术通过设计QX基因型的特异性引物建立有效的RT‑PCR检测方法，仅需通过一次RT‑PCR反应就能达到对QX基因型的IBV进行分型检测的目的。该试剂盒在同一PCR反应条件下，将2对引物加入同一个PCR体系中，既能有效地检测出临床样品或鸡胚尿囊液中的IBV，也能特异性地将QX型基因型的IBV区分出来。该检测方法快速高效、准确，对于指导疫苗的选用以及IB的快速防控都具有很大的意义。
【技术实现步骤摘要】
一种鸡传染性支气管炎病毒QX型毒株鉴别检测试剂盒
本专利技术属于生物检测
，具体涉及鸡传染性支气管炎病毒QX毒株鉴别检测试剂盒。
技术介绍
鸡传染性支气管炎(InfectiousBronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisvirus，IBV)引起的急性、高度接触性传染病。该病可侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统以及消化系统等。是严重危害世界养禽业的重要传染病之一。鸡传染性支气管炎病毒属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属。其基因组是不分节段的正链RNA病毒，全长约27.6kb。病毒基因组从5’端到3’端依次为5’-1a-1b-S1-S2-3a-3b-3c-M-5a-5b-N-poly(A)-3’。IBV含4种主要结构蛋白：纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、小囊膜蛋白(E)。IBV的抗原决定簇大部分位于S蛋白，S蛋白不仅能介导病毒与易感细胞发生融合，决定病毒的毒力，且决定病毒的抗原性。IBV在转录过程中使用相同的先导序列转录不同片段的独特转录机制，再加上RNA酶缺乏校对机制，使IBV的基因组易出现点突变、缺失、插入和重组，最终导致IBV毒株的变异，不断出现新的血清型与基因型。大量研究表明，IBV的S1基因是变异频率与变异程度最高的基因，基于S1基因的IBV分型以及遗传进化分析成为近年来一大研究热点。通过对IBV的S1基因进行系统进化分析后可将各种IBV分成不同基因型的毒株。目前在我国普遍流行的是QX基因型的IBV毒株。IBVQX型毒株过去在1990s只在中国流行，2000s以后已广泛流行于世界各地包括欧洲和俄罗斯等国家。常规疫苗对QX毒株的感染不能提供保护。因此QX毒株的流行给养鸡业造成了很大的经济损失。临床上急需对QX基因型的IBV毒株进行特异性快速鉴别诊断，以便及时指导疫苗的选用，减少IBV感染造成的损失。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种鸡传染性支气管炎病毒QX型毒株鉴别检测试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术的解决方案是：提供一种用于鸡传染性支气管炎病毒QX型毒株鉴别检测的试剂盒，包括下述两对引物：用于扩增传染性支气管炎病毒的通用引物和用于特异性扩增QX基因型毒株的引物；其序列如下：通用-F：5'-CCAAAGTGCCTTCAGACC-3'(如SEQIDNO：3所示)通用-R：5'-GCTAGACCAAGCCATACC-3'(如SEQIDNO：4所示)QX-F：5'-GTCATTTCTGAGTCAGTTTGTG-3'(如SEQIDNO：5所示)QX-R：5'-TGCGTTAATACTAAGGGCTC-3'(如SEQIDNO：6所示)。本专利技术中，所述试剂盒包括下述成分：(1)RNA提取试剂：Trizol试剂；(2)反转录试剂：5×反应缓冲液，10mM的dNTPMix，0.2μg/μl的随机引物，20U/μlRnase抑制剂，200U/μl的反转录酶，Nuclease-free水；(3)PCR反应试剂：2×TaqMasterMix，灭菌双蒸水；(4)分型引物：所述通用引物和QX基因型毒株特异性引物的浓度均为10μM；(5)阳性对照样品：QX基因型毒株核酸抽提物的反转录产物cDNA；(6)阴性对照样品：正常鸡胚尿囊液抽提RNA的反转录产物cDNA。本专利技术中，所述阳性对照样品是QX基因型毒株IBV-HF感染鸡胚的尿囊液抽提RNA的反转录产物cDNA。本专利技术提供的试剂盒，其使用方法包括以下步骤：(1)从待测拭子、组织或感染鸡胚尿囊液样品中提取总RNA：在1.5mlEP管中加500μl处理好的拭子、组织或感染鸡胚尿囊液样品后(不足500μl的可以用灭菌PBS补足500μl)，加入500μlTrizol试剂，充分混匀，室温静置5min；加200μl氯仿，充分混匀15s，室温静置5min；4℃，12000rpm离心10min；取上清(400-600μl)加等体积的异丙醇，轻微混匀，室温静置5min；4℃，12000rpm离心10min；弃去上清，加1ml75％乙醇，4℃，12000rpm离心7min；弃去上清，沉淀干燥10-15min，加10μlNuclease-free水溶解，得总RNA。(注：RNA抽提时所用的枪头和EP管应不含RNA酶)(2)以上一步骤提取的总RNA为模板，进行反转录反应。反应的体系为：11μl总RNA模板，4μl的5×反应缓冲液,2μl的10mM的dNTPMix,1μl的0.2μg/μl的随机引物，1μl20U/μl的Rnase抑制剂,1μl200U/μl的反转录酶，共20μl。混匀后在42℃恒温反应1h，然后70℃恒温终止反应10min，得cDNA。(3)以所述反转录产物cDNA为模板，利用两对分型引物进行PCR扩增，所述PCR体系为：2×TaqMasterMix12.5μl，10μM通用上下游引物(通用-F,通用-R)各0.8μl，10μMQX基因型引物(QX-F,QX-R)各0.4μl，cDNA模板1μl，加灭菌双蒸水(ddH2O)至25μl。所述PCR反应体系的反应条件为：95℃预变性5min，然后进入95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s循环，共35个循环，72℃延伸10min，16℃5min；(4)取所述PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后判断结果。本专利技术中，对QX基因型IBV毒株RT-PCR扩增获得约200bp和340bp的两条带，对非QX毒株扩增仅获得约200bp一条带。QX毒株IBV-HF扩增获得的PCR产物为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的两段核苷酸序列。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术通过设计QX基因型的特异性引物，建立有效的RT-PCR检测方法。仅需通过一次RT-PCR反应就能达到对QX基因型的IBV进行分型检测的目的。2、该试剂盒在同一PCR反应条件下，将2对引物加入同一个PCR体系中，既能有效地检测出临床样品或鸡胚尿囊液中的IBV，也能特异性地将QX型基因型的IBV区分出来。3、该检测方法快速高效、准确，对于指导疫苗的选用以及IB的快速防控都具有很大的意义。附图说明图1为试剂盒RT-PCR扩增IBV-HF毒株(QX型)、M41(非QX型)的结果。图中，M.100bpmarker；1.阴性对照；2.M41；3.IBV-HF图2为试剂盒RT-PCR特异性扩增IBV的结果。图中，M.100bpmarker；1.阴性对照；2-6.NDV、AIVH5亚型、AIVH7亚型、AIVH9亚型、IBDV；7.M41；8.IBV-HF。图3为试剂盒检测所选毒株的验证结果。图中，M.100bpmarker；1.阴性对照；2-6.NDV、AIVH5亚型、AIVH7亚型、AIVH9亚型、IBDV；7.IBV-GX-1023(LDT-3型)；8.4/91；9-14.M41、H120、H52、ZJ971、JH06011、JH06111(Mass型)；15-18.IBV-SD、IBV-QX-H120、IBV-GX-0808、IBV-HF(QX型)。具体实施方式本专利技术中所利用的试剂盒组成包括：(1)RNA提取试剂：Trizol试剂；(2)反本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鸡传染性支气管炎病毒QX型毒株鉴别检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括两对引物，分别是用于扩增传染性支气管炎病毒的通用引物和用于特异性扩增QX基因型毒株的引物；其中，用于特异性扩增QX基因型毒株的引物的序列如下：QX‑F：5'‑GTCATTTCTGAGTCAGTTTGTG‑3'QX‑R：5'‑TGCGTTAATACTAAGGGCTC‑3'。
【技术特征摘要】
1.一种用于鸡传染性支气管炎病毒QX型毒株鉴别检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括两对引物，分别是用于扩增传染性支气管炎病毒的通用引物和用于特异性扩增QX基因型毒株的引物；其中，用于特异性扩增QX基因型毒株的引物的序列如下：QX-F：5'-GTCATTTCTGAGTCAGTTTGTG-3'QX-R：5'-TGCGTTAATACTAAGGGCTC-3'。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于扩增传染性支气管炎病毒的通用引物的序列如下：通用-F：5'-CCAAAGTGCCTTCAGACC-3'通用-R：5'-GCTAGACCAAGCCATACC-3'。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括下述成分：(1)RNA提取试剂：Trizol试剂；(2)反转录试剂：5×反应缓冲液，10mM的dNTPMix，0.2μg/μl的随机引物，20U/μlRnase抑制剂，200U/μl的反转录酶，Nuclease-free水；(3)PCR反应试剂：2×TaqMasterMix，灭菌双蒸水；(4)分型引物：所述通用引物和QX基因型毒株特异性引物的浓度均为10μM；(5)阳性对照样品：QX基因型毒株核酸抽提物的反转录产物cDNA；(6)阴性对照样品：正常鸡胚尿囊液抽提RNA的反转录产物cDNA。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照样品是QX基因型毒株IBV-HF感染鸡胚的尿囊液抽提RNA的反转录产物cDNA。5.权利要求1所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从待测拭子、组织或感染鸡胚尿囊液样品中提取总...
【专利技术属性】
技术研发人员：周继勇，陶春豪，廖敏，颜焰，曹尚尚，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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