用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物、检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、检测方法及试剂盒。利用逆转录酶将待检测基因的mRNA逆转录成CDNA，并根据对靶基因的6个区域设计了4种特异的引物，利用Bst DNA聚合酶在63‑65℃左右扩增1h，完成核酸扩增反应。该方法不仅特异性高、而且快速准确，可以准确的排除样品中死菌的干扰，避免死菌带来的假阳性。

【技术实现步骤摘要】
用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物、检测方法及试剂盒
本专利技术属于食品安全检测领域，具体涉及一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、检测方法及试剂盒。
技术介绍
单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)简称单增李斯特菌。单增李斯特菌可以感染许多食品，包括家畜肉、发酵香肠和海产品等。WHO将其与大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌并列为20世纪90年代四大食源性致病菌。它是李斯特菌属中致病力最强的细菌。单增李斯特菌在自然界分布广泛，如在腐烂的植物、土壤、动物粪便、污水中均有发现；在乳肉蛋制品、蔬菜和水产品中也都有不同程度的污染。奶酪、凉拌卷心菜、热狗、禽肉等是引起李斯特菌病的常见食品。由于单增李斯特菌作为人畜共患病菌，分布广泛，4℃下正常繁殖，对食品安全构成了严重的威胁，因此各国对食品中单增李斯特菌纷纷做出规定美国要求出售食品中不得出现单增李斯特菌。加拿大规定即食食品中单增李斯特菌的数量不超过100cfu/g。这些规定要求能够准确地测出食品中的少量单增李斯特菌。目前单增李斯特菌的鉴定多采用国标法、酶联免疫法、PCR方法、LAMP法。1、生理生化检测法(国标法)国家标准中EB增菌法和LB增菌法，通过微生物的分离培养、生化反应、溶血试验、协同溶血试验、动物试验等进行分离鉴定。实验设备要求不高，可操作性强，但检验周期长，需6-7天。这种传统的检测方法已无法满足食品生产过程中的在线检测、食品上市和消费前的快速检测的要求。2、酶联免疫法免疫测定是基于抗体对抗原亲和力的一种检测技术，该方法不易受到样品中其他成分的干扰，可以精确测定少量样品中的抗原。免疫学检测法操作快捷，特异性强，灵敏度高，但是制备单克隆抗体的成本较高。而且李斯特菌的菌体和鞭毛之间存在抗原交叉反应，降低了检测的特异性。3、核酸检测法(1)聚合酶链式反应法(PCR法)PCR技术自1980年被专利技术以来，已经得到了广泛的应用。其方法是用一对寡聚DNA作为引物，将要扩增的DNA经过高温解链，退火，最后进行复制延伸。如此重复25～35个循环就可以得到大量DNA。单增李斯特菌的检测，其特异性引物的设计一种是依据它的特异毒力基因序列(常用hlyA，iap，inl，Dth)，一种是依据它的基因组序列中的特异序列(16S或16S/23S中间的保守区域)。姜永强等以单增李斯特菌的hlyA毒力基因为靶序列，可检出4cfu/mL的牛奶。Wang等以PCR扩增单增李斯特菌的iap毒力基因片断，可检出1～2cfu/mL牛奶样品。Graham等用16S/23SrRNA基因中间保守区域进行PCR扩增，对单增李斯特菌的特异性进行了研究，为检测提供了依据。然而普通PCR过程中涉及多个温度的变换，需要用到昂贵的PCR仪和凝胶成像仪等设备，不适应非实验室条件下的现场检测。且PCR检测不能区分样品中死亡的单增李斯特菌，经常造成会造成假阳性的结果。(2)LAMP法环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是由日本人Notomi研制出的一种新型的核酸检测法(14)。LAMP分析方法具有特异性好、灵敏度高和成本低等优点(15)。该方法已成为食品工业和公共卫生机构(14)在不需要精密设备的情况下快速诊断微生物的一个有价值的工具。然而，由于LAMP也是检测样品中的DNA，所以也容易因死菌引起假阳性。因此如果有一种检测方法，可以快速、灵敏、准确，且不需要复杂的试验设备，可以在野外条件下检测病原菌，就可以及时有效地控制食品链中的污染。(3)RT-LAMP法目前RT-LAMP也被用于检测RNA病毒的基因组，目前已经开发了多个病毒检测试剂盒(16，17)。但是目前尚未有RT-LAMP被用于检测细菌的报道。用RT-LAMP技术去检测细菌的RNA，可以准确的排除样品中死菌的干扰。由于细菌死亡后，RNA会迅速分解，因此RNA可以作为活体的一个标志代替DNA进行检测。本专利技术设计的检测片段为RNA，由于在细胞中具有多份RNA拷贝，因此检测的灵敏度高于检测DNA的常规LAMP技术。本专利描述一种快速、灵敏、准确的快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的方法。
技术实现思路
为了解决现有单增李斯特菌的检测方法不简便、灵敏度低、时间长、特异性差、假阳性高的技术缺陷，本专利技术提供了一种逆转录单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物组，可用于检测食品中单增李斯特菌。用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组，其特征在于，所述引物组序列为：F3：GCTGCTGAAAAAACAGAGAA；B3：TGCTTACTGCTTTGTCAGT；FIP：TTGTTCCACCTTTGATGGACGTAATAAGCGCAACTTGGTTAAACG；BIP：GTAACTGTTGAAACAACCGAATCTAACAGTATTTACCGTTAACGAAACC。本专利技术的第二个目的是提供一种检测单增李斯特菌的试剂盒。用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品预处理液、反应液、BstDNA聚合酶、阳性对照液和上述引物组。进一步地，所述引物组的体积比F3-F∶B3-R∶FIP∶BIP为1∶1∶2.5∶2.5。所述反应液是由体积比为3∶3∶1∶2的10×Thermopol反应缓冲液，1.2mMdNTPs，2.0mMMgSO4和1M甜菜碱组成。优选地，所述10×Thermopol反应缓冲液含有200mMpH8.8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为1％曲拉通X-100。进一步地，所述BstDNA聚合酶每微升含8～16个活性单位。所述试剂盒还包括显色剂，显色剂为荧光染料，优选为SYBRGreenI。本专利技术的第三个目的是提供检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤：1)单核细胞增生李斯特氏菌RNA的提取；2)用AMV逆转录酶进行逆转录；3)单核细胞增生李斯特氏菌的环介导等温扩增：将配制好的PCR管于60-65℃反应1-1.5小时，80℃终止反应；其中反应体系总体积为25μL，其中包括3μL10×Thermopol反应缓冲液、3μLdNTPs、1μLMgSO4、2.5μlFIP、2.5μlBIP、1μlF3、1μlB3、2μl甜菜碱、1μlBstDNA聚合酶和8μl待检逆转录CDNA；引物组序列为：F3：GCTGCTGAAAAAACAGAGAA；B3：TGCTTACTGCTTTGTCAGT；FIP：TTGTTCCACCTTTGATGGACGTAATAAGCGCAACTTGGTTAAACG；BIP：GTAACTGTTGAAACAACCGAATCTAACAGTATTTACCGTTAACGAAACC。5)分析判断反应产物结果：在反应产物中加入2.5μl荧光染料，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者10000g离心后，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显沉淀的为阳性，未见沉淀的为阴性。进一步地，环介导等温扩增温度为63℃，反应时间1小时。本专利技术是一种利用逆转录环介号等温扩增技术快速检测样品单增李斯特菌活菌的方法，利用逆转录酶将待检测基因的mRNA逆转录成CD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组，其特征在于，所述引物组序列为：F3：GCTGCTGAAAAAACAGAGAA；B3：TGCTTACTGCTTTGTCAGT；FIP：TTGTTCCACCTTTGATGGACGTAATAAGCGCAACTTGGTTAAACG；BIP：GTAACTGTTGAAACAACCGAATCTAACAGTATTTACCGTTAACGAAACC。

【技术特征摘要】
1.用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组，其特征在于，所述引物组序列为：F3：GCTGCTGAAAAAACAGAGAA；B3：TGCTTACTGCTTTGTCAGT；FIP：TTGTTCCACCTTTGATGGACGTAATAAGCGCAACTTGGTTAAACG；BIP：GTAACTGTTGAAACAACCGAATCTAACAGTATTTACCGTTAACGAAACC。2.用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品预处理液、反应液、BstDNA聚合酶、阳性对照液和权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组的体积比F3∶B3∶FIP∶BIP为1∶1∶2.5∶2.5。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液是由体积比为3∶3∶1∶2的10×Thermopol反应缓冲液，1.2mMdNTPs，2.0mMMgSO4和1M甜菜碱组成。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述10×Thermopol反应缓冲液含有200mMpH8.8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为1％曲拉通X-100。6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述BstDNA聚合酶每微升含8～16个活性单位。7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括显色剂，显色...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋达峰，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33