一组同时检测ERCC基因多态性的引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一组同时检测ERCC基因多态性的引物，其包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；同时检测的位点包括ERCC1 rs11615、ERCC2 rs1799793、ERCC3 rs3738948；将该引物应用在化疗药物选择中，与常规的对多个位点进行单独扩增相比，不仅减少了扩增程序，降低了扩增成本，同时保证了高灵敏度、准确度以及精密度，保证了该方法的可靠性；有助于医生为患者正确选择药物和治疗方案，提高癌症患者的生存率。

【技术实现步骤摘要】
一组同时检测ERCC基因多态性的引物及其应用
本专利技术属于基因多态性检测领域，具体涉及一种同时检测ERCC基因多态性的引物及其应用。
技术介绍
癌症致死率仅次于心脑血管疾病，临床治疗手段以铂类药物为基础的化疗为主。铂类药物的作用靶点是DNA，通过链间交互作用，损伤DNA，减缓肿瘤细胞的恶性增殖速率。核苷酸切除修复（NER）在化疗药物作用后的损伤修复途径中发挥了重要作用。NER，是一条多功能的和复杂的DNA损伤的切除途径，通过识别DNA损伤而启动。这个过程中的主要步骤是DNA损伤位点处的双螺旋结构解螺旋，切除包含损伤的单链DNA片段，通过DNA合成修复间隙和填补剩余的单链缺口。本文所研究的三个基因ERCC1、ERCC2、ERCC3在核苷酸切除修复途径中发挥重要作用。其中ERCC1基因被认为是影响非小细胞肺癌铂类药物化疗疗效及预后的基因；ERCC2发挥解螺旋作用；有文献报道，在临床III期病人中，携带ERCC1rs11615TT/TC基因型的患者病情缓解率高于CC基因型；ERCC3rs3738948GG/GA基因型的患者病情缓解率高于AA基因型；患者放化疗的毒性与ERCC2rs1799793的单核苷酸多态性位点有关。因此，由于癌症患者本身以及患者个体之间异质性的存在，同一种类的肿瘤对同一化疗方案的敏感性及毒副作用反应差异很大，通过选择性对如DNA修复酶系统基因多态性位点检查，获得化疗疗效及毒副作用的预测因子，指导今后的个体化治疗，从而提高患者总的预后及无病生存率。现今临床上通过第三方检验公司协助，利用单基因测序的方法分别对这些位点的多态性进行检测；缺少一种特异性好、灵敏度高，准确度性好、可实现多个位点同时检测的技术和方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一组同时检测ERCC基因多态性的引物，即针对临床癌症治疗中铂类药物为基础的放化疗药物在DNA修复途径中的3个关键基因ERCC1、ERCC2、ERCC3的3个多态性位点：ERCC1rs11615、ERCC2rs1799793、ERCC3rs3738948，提供了同时检测ERCC1rs11615、ERCC2rs1799793、ERCC3rs3738948基因多态性的引物；引物包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；针对ERCC1rs11615PCR扩增的正向引物如SEQIDNO：1所示，反向引物如SEQIDNO：2所示，SNaPshotPCR引物如SEQIDNO：7所示；针对ERCC2rs1799793PCR扩增的正向引物如SEQIDNO：3所示，反向引物如SEQIDNO：4所示，SNaPshotPCR引物如SEQIDNO：8所示；针对ERCC3rs3738948PCR扩增的正向引物如SEQIDNO：5所示，反向引物如SEQIDNO：6所示，SNaPshotPCR引物如SEQIDNO：9所示。本专利技术同时检测ERCC1rs11615、ERCC2rs1799793、ERCC3rs3738948基因多态性的SNaPshot检测方法，首先提取癌症患者外周血白细胞基因组DNA，将其浓度定量到50ng/μL，然后通过多重PCR法扩增ERCC1rs11615、ERCC2rs1799793、ERCC3rs3738948所在序列，扩增产物纯化后将对应序列进行SNaPshotPCR扩增，扩增产物纯化后通过毛细管电泳法检测荧光信号并通过软件分析确定SNP位点及基因型。上述检测方法具体包括如下步骤：（1）DNA提取：采用酚氯仿法提取外周血样本中白细胞基因组DNA，通过检测所提DNA浓度，并将其稀释到50ng/μL；（2）多重PCR法扩增ERCC1rs11615、ERCC2rs1799793、ERCC3rs3738948所在序列，总体系15μL的反应体系中包含：ddH2O：6.0μL；2×MultiplexBuffer：7.5μL；MultiplexDNAPolymerase：0.6μL；PrimerMix：0.3μL；最后在体系中分别加入0.6μL的50ng/μL的DNA模板。混匀后将PCR反应管置于PCR仪上并将反应程序设置如下：1：95℃，5min；2：95℃，30s；60℃，2min；72℃，2min；该步骤循环35次；3：72℃，10min；4：4℃；（3）多重PCR产物纯化：取15μL步骤（2）中的产物，加入5UCIAP及2UExol，混合均匀后置于PCR仪，按如下程序反应：1：37℃，60min；2：75℃，15min；3：4℃；纯化的产物稀释到50ng/μL；（4）SNaPshotPCR扩增：SNaPshotPCR反应体系为：ddH2O：2.5μL；5×SequencingBuffer：2μL；MultiplexReadyReactionMix：0.5μL；PrimerMix：1μL；步骤（3）中纯化后稀释的产物：4μL；其中引物混合物的比例如下：rs11615-SBE-F：rs1799793-SBE-F：rs3738948-SBE-R=1:6:2；将上述体系充分混匀微离，置入PCR仪执行如下程序：1：96℃，10s；50℃，5s；60℃，30s；循环25次；2：4℃；（5）SNaPshotPCR扩增产物纯化：向SNaPshotPCR扩增产物中加入1UCIAP酶，按以下程序进行反应：1：37℃，60min；2：75℃，15min；3：4℃；（6）SNaPshot分析：将步骤5）获得的产物用ABI3500-Dx基因分析仪毛细管电泳法检测荧光信号，通过Genemapper5软件分析确定基因型。本专利技术另一目的是将上述引物应用在癌症患者化疗药物及放化疗治疗方案的选择中。本专利技术提供的一组同时检测ERCC1rs11615、ERCC2rs1799793、ERCC3rs3738948基因多态性的引物，采用SNaPshot检测方法，通过多重PCR对3个SNP位点所在的基因片段进行扩增程序，同时采用SNaPshot技术进行检测，与常规的对多个位点进行单独扩增和检测的方法相比，不仅减少了扩增程序，降低了扩增成本，同时保证了高灵敏度，准确度及精密度，保证了该检测方法的可靠性。本专利技术提供的检测方法能够在临床上非小细胞肺癌放化疗药物使用前进行ERCC1rs11615、ERCC2rs1799793、ERCC3rs3738948基因多态性检测，判定患者对铂类为基础的放化疗药物的敏感性，有助于医生为患者正确选择药物，提高疾病的预后。附图说明图1为ERCC1rs11615、ERCC2rs1799793、ERCC3rs3738948基因扩增产物Sanger测序图；图2为SNaPshot法检测ERCC1rs11615、ERCC2rs1799793、ERCC3rs3738948的图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。实施例1：ERCC1rs11615、ERCC2rs1799793、ERCC3rs3738948基因多态性SNaPshot检测本检测方法是通过多重PCR法扩增待检测SNP位点所在基因片段后，采用荧光标记单碱基延本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组同时检测ERCC基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；同时检测的位点包括ERCC1 rs11615、ERCC2 rs1799793、ERCC3 rs3738948；针对ERCC1 rs11615 PCR扩增的正向引物如SEQ ID NO：1所示，反向引物如SEQ ID NO：2所示，SNaPshot PCR引物如SEQ ID NO：7所示；针对ERCC2 rs1799793 PCR扩增的正向引物如SEQ ID NO：3所示，反向引物如SEQ ID NO：4所示，SNaPshot PCR引物如SEQ ID NO：8所示；针对ERCC3 rs3738948 PCR扩增的正向引物如SEQ ID NO：5所示，反向引物如SEQ ID NO：6所示，SNaPshot PCR引物如SEQ ID NO：9所示。

【技术特征摘要】
1.一组同时检测ERCC基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；同时检测的位点包括ERCC1rs11615、ERCC2rs1799793、ERCC3rs3738948；针对ERCC1rs11615PCR扩增的正向引物如SEQIDNO：1所示，反向引物如SEQIDNO：2所示，SNaPshotPCR引物如SEQIDNO：7所示；针对ERCC2rs...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宁，唐文如，罗瑛，旦菊花，盛苗苗，张继虹，贾舒婷，吴晓明，刘静，谢晓丽，周若宇，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53