本发明专利技术公开了一组同时检测ERCC4和XRCC1基因多态性的引物，其包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，同时检测的位点包括ERCC4 rs1799801和XRCC1 rs25487；将引物应用在临床化疗药物选择中，与常规的对多个位点进行单独扩增相比，不仅减少了扩增程序，降低了扩增成本，同时保证了高灵敏度、准确度以及精密度，保证了该方法的可靠性；有助于医生为患者正确选择药物和治疗方案，提高癌症患者的生存率。
【技术实现步骤摘要】
一组同时检测ERCC4和XRCC1基因多态性的引物及应用
本专利技术属于基因多态性检测领域，具体涉及一组同时检测ERCC4和XRCC1基因多态性的引物及应用。
技术介绍
癌症致死率仅次于心脑血管疾病，临床治疗手段以铂类药物为基础的化疗为主；铂类药物的作用靶点是DNA，通过链间交互作用，损伤DNA，减缓肿瘤细胞的恶性增殖速率，而DNA修复能力的单核苷酸多态性影响患者的预后；核苷酸切除修复（NER），是一条多功能的和复杂的DNA损伤的切除途径，通过识别DNA损伤而启动。这个过程的主要步骤是DNA损伤位点处的双螺旋结构解螺旋，切除包含损伤的单链DNA片段，通过DNA合成修复间隙和填补剩余的单链缺口。碱基切除修复（BER）主要修复碱基或片段的氧化或还原、非堆积性化合物、甲基化作用的产物等所造成的损伤，包括由铂类药物和放射治疗引起的。本文所研究的两个基因ERCC4和XRCC1分别在核苷酸切除修复和碱基切除修复途径中发挥重要作用；有文献支撑在Ⅳ期患者中，铂类药物疗效与ERCC4基因的多态性有关，生存率与XRCC1基因的多态性相关；在我国有数据支持在251例接受以铂类为基础药物化疗的III期和Ⅳ期非小细胞肺癌（NSCLC）患者XRCC1基因第399位密码子的SNP，发现增加变异型等位基因的个数可使患者总生存期明显下降，表明含有等位基因AA可导致修复能力下降，对铂类药物敏感性增强，疗效增加。因此，由于癌症患者本身以及患者个体之间异质性的存在，同一种类的肿瘤对同一化疗方案的敏感性及毒副作用反应差异很大，通过选择性对如DNA修复酶系统基因、X线修复交叉互补基因的多态性位点检查，获得化疗疗效及毒副作用的预测因子，指导今后的个体化化疗，从而提高患者总的预后及无病生存率。现今临床上通过第三方检验公司协助，利用单基因测序的方法分别对这些位点的多态性进行检测；缺少一种特异性好、灵敏度高，准确度性好、可实现多个位点同时检测的技术和方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种同时检测ERCC4和XRCC1基因多态性的引物，即针对临床癌症治疗中铂类药物为基础的放化疗药物在核苷酸切除修复途径和碱基切除修复途径中的2个关键基因：ERCC4、XRCC1，2个多态性位点：ERCC4rs1799801、XRCC1rs25487；利用SNaPshot法同时对2个基因的2个位点进行检测；同时检测ERCC4和XRCC1基因多态性的引物包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；针对ERCC4rs1799801PCR扩增的正向引物如SEQIDNO：1所示，反向引物如SEQIDNO：2所示，SNaPshotPCR引物如SEQIDNO：5所示；针对XRCC1rs25487PCR扩增的正向引物如SEQIDNO：3所示，反向引物如SEQIDNO：4所示，SNaPshotPCR引物如SEQIDNO：6所示；本专利技术同时检测ERCC4rs1799801、XRCC1rs25487基因多态性的SNaPshot检测方法，首先提取人体外周血白细胞基因组DNA，将其浓度定量到50ng/μL，然后通过多重PCR法扩增ERCC4rs1799801、XRCC1rs25487所在序列，扩增产物纯化后将对应序列进行SNaPshotPCR扩增，扩增产物纯化后通过毛细管电泳法检测荧光信号并通过软件分析确定SNP位点及基因型。上述检测方法具体包括如下步骤：（1）DNA提取：采用酚氯仿法提取外周血样本中白细胞基因组DNA，通过检测所提DNA浓度，并将其稀释到50ng/μL；（2）多重PCR法扩增ERCC4rs1799801、XRCC1rs25487所在序列，总体系15μL的反应体系中包含：ddH2O：6.0μL；2xMultiplexBuffer：7.5μL；MultiplexDNAPolymerase：0.6μL；PrimerMix：0.3μL；最后在体系中分别加入0.6μL的50ng/μL的DNA模板；混匀后将PCR反应管置于PCR仪上并将反应程序设置如下：1：95℃，5min；2：95℃，30s；60℃，2min；72℃，2min；该步骤循环35次；3：72℃，10min；4：4℃；（3）多重PCR产物纯化：取15μL步骤（2）中的产物，加入5UCIAP及2UExol，混合均匀后置于PCR仪，按如下程序反应：1：37℃，60min；2：75℃，15min；3：4℃；纯化的产物稀释到50ng/μL；（4）SNaPshotPCR扩增：SNaPshotPCR反应体系为：ddH2O：2.5μL；5xSequencingBuffer：2μL；MultiplexReadyReactionMix：0.5μL；PrimerMix：1μL；步骤3）中纯化后稀释的产物：4μL；其中引物混合物的比例如下：rs1799801-SBE-F：rs25487-SBE-F=2:3；将上述体系充分混匀微离，置入PCR仪执行如下程序：1：96℃，10s；50℃，5s；60℃，30s；循环25次；2：4℃；（5）SNaPshotPCR扩增产物纯化：向SNaPshotPCR扩增产物中加入1UCIAP酶，按以下程序进行反应：1：37℃，60min；2：75℃，15min；3：4℃；（6）SNaPshot分析：将步骤（5）获得的产物用ABI3500-Dx基因分析仪毛细管电泳法检测荧光信号，通过Genemapper5软件分析确定基因型。本专利技术另一目的是将上述引物应用在癌症患者化疗药物及放化疗治疗方案的选择中。本专利技术提供的同时检测ERCC4rs1799801、XRCC1rs25487基因多态性SNaPshot检测方法通过采用多重PCR对2个SNP位点所在的基因片段进行扩增程序，同时采用SNaPshot技术进行检测，与常规的对多个位点进行单独扩增和检测的方法相比，不仅减少了扩增程序，降低了扩增成本，同时保证了高灵敏度，准确度及精密度，保证了该检测方法的可靠性。本专利技术提供的检测方法能够在临床癌症患者化疗药物及放化疗治疗方案的选择前进行ERCC4rs1799801、XRCC1rs25487基因多态性检测，判定患者对铂类为基础的放化疗药物的敏感性，有助于医生为患者正确选择药物，提高疾病的预后。附图说明图1为ERCC4rs1799801、XRCC1rs25487基因扩增产物Sanger测序图；图2为SNaPshot法检测ERCC4rs1799801、XRCC1rs25487的图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。实施例1：ERCC4rs1799801、XRCC1rs25487基因多态性SNaPshot检测本检测方法是利用所公开的一组同时检测ERCC4rs1799801、XRCC1rs25487基因多态性的引物，通过多重PCR法扩增待检测SNP位点所在基因片段后，采用荧光标记单碱基延伸技术（SNaPshot）结合毛细管电泳技术进行基因多态性检测，检测结果应用GENEMAPPER5软件进行分析，根据峰的移动位置确定延伸产物对应的SNP位点，根据峰的荧光信号确定该SNP位本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组同时检测ERCC4和XRCC1基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，同时检测的位点包括ERCC4 rs1799801和XRCC1 rs25487；针对ERCC4 rs1799801 PCR扩增的正向引物如SEQ ID NO：1所示，反向引物如SEQ ID NO：2所示，SNaPshot PCR引物如SEQ ID NO：5所示；针对XRCC1 rs25487 PCR扩增的正向引物如SEQ ID NO：3所示，反向引物如SEQ ID NO：4所示，SNaPshot PCR引物如SEQ ID NO：6所示。
【技术特征摘要】
1.一组同时检测ERCC4和XRCC1基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物，同时检测的位点包括ERCC4rs1799801和XRCC1rs25487；针对ERCC4rs1799801PCR扩增的正向引物如SEQIDNO：1所示，反向引物如SEQIDNO：2所示，S...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘宁，唐文如，罗瑛，旦菊花，盛苗苗，张继虹，贾舒婷，吴晓明，刘静，谢晓丽，周若宇，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53
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