荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒及其应用技术

本发明专利技术涉及荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括检测FMR1基因启动子区域甲基化的以下PCR引物和探针，引物和探针中设计有是针对FMR1基因甲基化位点进行设计的碱基。本发明专利技术试剂盒相对于PCR毛细管电泳方法，荧光定量PCR方法针对FMR1甲基化进行检测，不受(CGG)n重复数次数过多的限制，因此不容易造成漏诊；而相对于MS‑PCR，荧光定量PCR方法除了引物上带有针对甲基化位点检测的特异性，还在探针上也增加了对甲基化位点检测的特异性。

【技术实现步骤摘要】
荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒及其应用
本专利技术涉及分子诊断领域，特别涉及荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒及其应用。
技术介绍
脆性X综合征(FragileXSyndrome,FXS)是仅次于唐氏综合征的发病率第二高的遗传性智力低下疾病，为不完全显性X连锁遗传病。脆性X综合征智力低下基因I(FragileXMentalRetardationI,FMR1)位于染色体Xq27.3，在基因组序列约38Kb，由17个外显子和16个内含子组成。FXS的分子遗传学基础是FMR1基因5'端非编码区(CGG)n的数目不同，分为正常、前突变、全突变。(CGG)n重复序列的长短在人群中具有多态性。在FXS患者中，(CGG)n重复超过230次，甚至可达上千次，这种类型称为全突变。全突变经常伴随(CGG)n重复区和FMR1基因启动子区域的高度甲基化。另一种情况为FXS患者从其母亲处继承了异常的FRM1等位基因，他们的母亲或者携带了相似的异常重复，但由于女性X染色体的随机失活而没有表现异常表型，或者其FMR1等位仅是过渡形式，称为前突变。前突变的(CGG)n重复数为53-230个之间，小的前突变没有异常甲基化；大的前突变会出现部分甲基化。FXS临床表型包括智力低下、注意力障碍、有自闭症倾向。青春期后典型患者还具有高前额、大耳和下颌突出、大睾丸、关节活动度过大等体格特征。由于在青春期前患病儿童的临床表现无特异性，所以疾病诊断和筛查主要依据实验室诊断方法。目前常用的分子诊断方法有PCR毛细管电泳法，甲基化特异PCR方法(MS-PCR)。PCR毛细管电泳法是针对FMR1基因的(CGG)n重复区域设计合适的引物，扩增该重复区域，扩增片段大小将由(CGG)n重复次数决定，通过毛细管电泳区分PCR产物的大小，根据该大小推算出(CGG)n重复数。PCR毛细管电泳方法的优点是对于正常和小的前突变尤其有效。但大的全突变扩增就困难，可能导致漏诊。MS-PCR方法是针对FMR1基因的全突变和大的前突变会引发FMR1基因的启动子区发生甲基化的情形来实现诊断的。但MS-PCR最终需要通过电泳方式来检测是否存在甲基化，难以做大量样本的筛查。并且MS-PCR中只单靠PCR引物的特异性来区分甲基化和非甲基化状态的DNA，特异性并不好。
技术实现思路
本专利技术提供一种荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括检测FMR1基因启动子区域甲基化的以下PCR引物和探针：上游引物：下游引物：和探针序列：其中斜粗体字的碱基是针对FMR1基因甲基化位点进行设计的碱基。在一种实施方式中，所述探针序列的5’端带有荧光报告基团VIC，3’端带有荧光淬灭基团MGB。在一种实施方式中，所述扩增内参基因为人Actb基因基因；Actb基因上游引物：GTGTATAGGAGAGTATTAGGAAGTGGT，Actb基因下游引物：CCACTAAACCTCCATTCAACTAACC；和Actb基因探针的序列为：AAAACAAAAACTCCAACCCCACCC。在一种实施方式中，所述Actb基因探针5’端带有荧光发光基团VIC，3’端带有荧光淬灭基团MGB。在一种实施方式中，提供上述试剂盒在脆性X综合征检测中的应用。本专利技术针对毛细管电泳和MS-PCR的缺陷，使用了荧光定量PCR方法检测FMR1基因甲基化的状态。相对于PCR毛细管电泳方法，荧光定量PCR方法针对FMR1甲基化进行检测，不受(CGG)n重复数次数过多的限制，因此不容易造成漏诊；而相对于MS-PCR，荧光定量PCR方法除了引物上带有针对甲基化位点检测的特异性，还在探针上也增加了对甲基化位点检测的特异性，针对甲基化检测的特异性上优于MS-PCR；并且荧光定量方法无需再通过电泳而是在线观察结果，也减少了污染的可能性。本专利技术的引物和探针都不能和未发生甲基化的序列起反应。本专利技术引物和探针的设计巧妙地包括了甲基化的位点，使得大大降低了非特异性的现象。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1是本专利技术检出的脆性X阳性样本(图1a)和阴性样本(图1b)的荧光定量结果展示图，其中短散点线条表示FMR1基因甲基化探针；长散点线表示内参基因Actb探针；和图2是用普通引物和探针检测阴性样品的荧光定量结果展示图，短虚线是针对FMR1基因甲基化的引物、探针设计，短散点线条表示FMR1基因甲基化探针，短虚线部分有非特异性的反应起峰，长散点线表示内参基因Actb探针。具体实施方式为了使本领域
人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本专利技术作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。实施例一.FMR1基因进行qPCR方法检测甲基化的引物和探针为克服上述提到的MS-PCR方法中的缺陷，本专利技术提供了基于荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒。本专利技术中涉及的引物、探针序列如下表1。表1.FMR1基因进行qPCR方法检测甲基化的引物和探针其中下划线加粗的碱基是针对FMR1基因甲基化位点进行设计的，qPCR产物大小为143bp。其中探针5’端带有荧光报告基团FAM，3’端带有荧光淬灭基团MGB。上游引物中CG中的下游引物中GC中的都是针对发生了甲基化的序列经过亚硫酸盐处理后仍然保持或者的特点来设计的；若没有发生甲基化，则经过亚硫酸盐处理后这个位置的序列就变成了T。因此本引物和探针都不能和未发生甲基化的序列起反应。本专利技术引物和探针的设计巧妙地包括了甲基化的位点，使得大大降低了非特异性的现象；但若甲基化位点位置不好，即使引物、探针包括甲基化位点，就有非特异性的现象。为了监测qPCR反应体系是否正常工作，还同时加入了内参基因人的Actb基因，Actb基因的引物、探针如下表2。表2.内参基因Actb基因进行qPCR方法检测的引物和探针名称序列(5’-3’)序列号Tm值Actb-F(上游引物)GTGTATAGGAGAGTATTAGGAAGTGGTSEQIDNO:458.1Actb-R(下游引物)CCACTAAACCTCCATTCAACTAACCSEQIDNO:558.3Actb-P(探针)AAAACAAAAACTCCAACCCCACCCSEQIDNO:663.3其中探针5’端带有荧光报告基团VIC，3’端带有荧光淬灭基团MGB。实施例二.本专利技术试剂盒的应用本专利技术所检测的标本类型为外周全血的临床样本，血样在提取基因组DNA后，先PCR+毛细管电泳法确认受检样本方法为脆性X阳性，以及脆性X阴性。提取的DNA，用400ng的量，用江苏敬善生物科技有限公司的亚硫酸盐处理试剂盒处理并回收经过转化后的DNA，经过洗脱后的DNA为60μl。通过以下荧光定量PCR反应体系进行反应，qPCR反应体系使用美国Promega公司的产品，如表3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测FMR1基因启动子区域甲基化的以下PCR引物和探针：上游引物：TGATTTTTTA

【技术特征摘要】
1.荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测FMR1基因启动子区域甲基化的以下PCR引物和探针：上游引物：TGATTTTTTAGTTATTGAGT；下游引物：GAATCAAAAACAAACC；和探针序列：CACTACCTCCAAAACCAA；其中斜粗体字的碱基是针对FMR1基因甲基化位点进行设计的碱基。2.根据权利要求1中所述的试剂盒，所述探针序列的5’端带有荧光报告基团VIC，3’端带有荧光淬灭基团MGB。3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡锦，张凤笑，
申请(专利权)人：佛山市顺德区辉锦创兴生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44