检测ABCG8内含子9突变的引物、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了检测植物固醇血症相关基因ABCG8内含子9区域35113delA缺失突变的引物、方法和试剂盒。采用Sanger测序技术，可快速发现该区域突变位点。该突变位点的发现便于判断和分析产生ABCG8基因突变是否会造成植物固醇血症，以及辅助查明造成该病的病因。

【技术实现步骤摘要】
检测ABCG8内含子9突变的引物、方法和试剂盒
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测植物固醇血症ABCG8基因内含子9突变的引物，采用普通PCR技术，可用于快速检测ABCG8内含子9的突变情况。
技术介绍
谷甾醇血症是一种常染色体隐性遗传疾病，其特征是血浆甾醇水平高(比正常人高10-25倍)。受胃肠道固醇血症影响的个体的其他特征是肌腱和结节性黄瘤、溶血性发作和关节炎，以及加速动脉粥样硬化和冠状动脉疾病。谷甾醇血症的个体中高水平的植物甾醇通常是由肠吸收增加引起的，因为谷甾醇ATP结合盒(ABC)转运体ABCG5或ABCG8在染色体2Pi上起作用，这是正常的，对甾醇的排泄起作用。所有的谷甾醇血症都是由ABCG8突变引起的(大约74％的病例)或ABCG5(约26％的病例)。检测ABCG8基因突变的目的是：1。辨别早期发生高胆固醇血症和高水平植物固醇血症患者的ABCG8遗传特征。2。对高胆固醇血症家族史的无症状家族成员进行家族性早发性高胆固醇血症和高水平的植物甾醇的疑似诊断的确认。ABCG8测序是通过扩增所有外显子和内含子/外显子边界进行的，然后进行双向Sanger测序。全基因测序的敏感性估计约99％的单核苷酸替换和/缺失。所有核苷酸变化的分析目前数据库和文献的预测致病性。谷甾醇血症基因(ABCG8)可以单独或作为一个面板进行测序。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测ABCG8基因内含子9突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测ABCG8基因内含子9的突变情况，并发现植物固醇血症遗传相关的突变类型，从而为判断植物固醇血症遗传信息提供依据。检测ABCG8内含子9基因突变的引物，其特征在于，包括扩增ABCG8基因内含子9序列的引物，其碱基序列为：ABCG8-intron9-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAATGAGGCTTATGGAGACTGTGABCG8-intron9-R:AACAGCTATGACCATGGTAGCTCGTGTTCTGCTGTCAA。进一步地，检测ABCG8内含子9基因突变的引物还包括测序引物，其碱基序列为：M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。本专利技术还提供了检测ABCG8内含子9基因突变的方法，包括以下步骤：(1)抽提血液中的基因组DNA；(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；其中扩增ABCG8基因内含子9序列的引物碱基序列为：ABCG8-intron9-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAATGAGGCTTATGGAGACTGTGABCG8-intron9-R:AACAGCTATGACCATGGTAGCTCGTGTTCTGCTGTCAA；(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；测序引物碱基序列为：M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG；(4)对测序结果进行判断，确定ABCG8内含子9基因是否发生突变。本专利技术还提供了一种检测ABCG8基因内含子9突变的试剂盒，包括(i)血液DNA抽提试剂；(ii)检测体系PCR扩增反应液；扩增ABCG8基因内含子9序列的引物碱基序列为：ABCG8-intron9-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAATGAGGCTTATGGAGACTGTGABCG8-intron9-R:AACAGCTATGACCATGGTAGCTCGTGTTCTGCTGTCAA；(iii)测序体系试剂；测序引物碱基序列为：M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。近年相关文献报道了植物固醇血症患者所产生的有关突变，本专利技术在ABCG8基因内含子9上发现了缺失突变点：35113delA。并且该突变位点在植物固醇血症患者中都存在，这在其他文献中并未报道。针对内含子9新发现的突变点，本专利技术设计了扩增ABCG8基因区域的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本专利技术利用测序技术检测ABCG8基因内含子9区域的方法，可以一次将ABCG8基因内含子9的新突变类型检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计2个探针，而且不能在同一管里检测，成本高，检测难度大。附图说明图1是一例ABCG8基因的内含子9发生缺失突变(35113delA)的测序图。通过MutaionSurveyor分析比对数据，得到如图临床分析报告，可以清楚显示缺失的位置。具体实施方式实施例1抽提血液中的DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。其中，所述10×红细胞裂解液配方为：NH4Cl82g，NaHCO38.4g，EDTA-Na23.72g，加ddH2O定容至1000ml。实施例2PCR扩增：PCR扩增体系试剂配制方法如下：反应条件如下：其中，引物序列为：ABCG8-intron9-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAATGAGGCTTATGGAGACTGTGABCG8-intron9-R:AACAGCTATGACCATGGTAGCTCGTGTTCTGCTGTCAA。实施例3PCR产物纯化：酶纯化按如下体系配置：CIP(NEB公司)0.1μl，ExoⅠ(NEB公司)0.5μl，去离子水1.4μl；最后加入9μlPCR产物。其纯化反应程序如下：37℃50min，95℃5min。实施例4Sanger测序反应：每反应体系5μl：Bigdye加1μl，3.2P引物加1μl，纯化后的模板加2μl，最后加入1μlddH2O。盖上管盖低速短暂离心，旋涡混匀，再次低速短暂离心。上PCR仪进行测序反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测ABCG8内含子9基因突变的引物，其特征在于，包括扩增ABCG8基因内含子9序列的引物，其碱基序列为：ABCG8‑intron9‑F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAATGAGGCTTATGGAGACTGTGABCG8‑intron9‑R:AACAGCTATGACCATGGTAGCTCGTGTTCTGCTGTCAA。

【技术特征摘要】
1.检测ABCG8内含子9基因突变的引物，其特征在于，包括扩增ABCG8基因内含子9序列的引物，其碱基序列为：ABCG8-intron9-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAATGAGGCTTATGGAGACTGTGABCG8-intron9-R:AACAGCTATGACCATGGTAGCTCGTGTTCTGCTGTCAA。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述ABCG8内含子9基因突变包括35113delA缺失突变。4.检测ABCG8基因内含子9突变的试剂盒，包括(i)血液DNA抽提试剂；(ii)检测体系PCR扩增反应液；扩增ABCG8基因内含子9序列的引物碱基序列为：ABCG8-intron9-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAAATGAGGCTTATGGAGACTGTGABCG8-intron9-R:AACAGCTATGACC...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑一，桑志高，吴鹏飞，
申请(专利权)人：南昌艾迪康临床检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36