检测ABCG8内含子4突变的引物、方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了检测植物固醇血症相关基因ABCG8内含子4区域12902T>C突变的引物、试剂盒和方法。采用Sanger测序技术，可快速发现该区域突变位点，该突变位点的发现便于判断和分析产生ABCG8基因突变是否会造成植物固醇血症，以及辅助查明造成该病的病因。

【技术实现步骤摘要】
检测ABCG8内含子4突变的引物、方法和试剂盒
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测植物固醇血症ABCG8基因内含子4突变的引物，采用普通PCR技术，可用于快速检测ABCG8内含子4的突变情况。
技术介绍
ABCG8基因是编码ATP结合盒(ABC)转运蛋白超家族成员。由该基因ABC蛋白编码的蛋白质通过跨细胞膜和胞内膜运输各种分子。ABC基因分为七个不同的亚家族(ABC1、MDR/TAP、MRP、ALD、OABP、GCN20和White)，该蛋白是白亚家族的成员。该基因编码的蛋白质的功能是排除非胆固醇甾醇进入肠道水平，促进胆固醇和甾醇排泄到胆汁中，并使甾醇转运回肠腔。它以组织特异性方式在肝肠和胆囊中表达。该基因在2号染色体上排列整齐，与家庭成员ABCG5呈头颅取向。该基因的突变可能导致甾醇积累和动脉粥样硬化，并已观察到在谷甾醇血症患者中ABCG8突变常染色体隐性遗传，无论是在家庭之间和家庭之内具有广泛的临床严重性。由于ABCG8没有热点突变，而且有许多突变没有被报导过。我们通过对ABCG8基因编码外显子的DNA测序、患者DNA在正向和反向上都被测序。如果发现突变，然后进行文献比对，从而确定是否是新的突变。发现ABCG8突变非常重要，因为任何ABCG8突变都会影响甾醇积累，而且有可能是家族性的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测ABCG8基因内含子4突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测ABCG8基因内含子4的突变情况，并发现植物固醇血症遗传相关的突变类型，从而为判断植物固醇血症遗传信息提供依据。检测ABCG8内含子4基因突变的引物，其特征在于，包括扩增ABCG8基因内含子4序列的引物，其碱基序列为：ABCG8-intron4-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCACCTCTCTAGGGGCTGGTCABCG8-intron4-R：AACAGCTATGACCATGCGGAAGGCAAGCTGAGTTGT。进一步地，检测ABCG8内含子4基因突变的引物还包括测序引物，其碱基序列为：M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。进一步地，ABCG8内含子4基因突变包括12902T>C突变点。本专利技术还提供了检测ABCG8内含子4基因突变的方法，包括以下步骤：(1)抽提血液中的基因组DNA；(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；其中扩增ABCG8基因内含子4的引物的碱基序列为：ABCG8-intron4-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCACCTCTCTAGGGGCTGGTCABCG8-intron4-R：AACAGCTATGACCATGCGGAAGGCAAGCTGAGTTGT；(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；测序引物的碱基序列为：M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG；(4)对测序结果进行判断，确定ABCG8内含子4基因位点是否发生突变。本专利技术还提供了一种检测ABCG8基因内含子4突变的试剂盒，包括(i)血液DNA抽提试剂；(ii)检测体系PCR扩增反应液；扩增ABCG8基因内含子4的引物的碱基序列为：ABCG8-intron4-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCACCTCTCTAGGGGCTGGTCABCG8-intron4-R：AACAGCTATGACCATGCGGAAGGCAAGCTGAGTTGT；(iii)测序体系试剂；测序引物的碱基序列为：M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。近年相关文献报道了植物固醇血症患者所产生的有关突变，本专利技术在ABCG8基因内含子4上发现了新的突变点12902T>C。并且该突变位点在植物固醇血症患者中都存在，这在其他文献中并未报道。针对内含子4新发现的突变点，本专利技术设计了扩增ABCG8基因区域的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本专利技术利用测序技术检测ABCG8基因内含子4区域的方法，可以一次将ABCG8基因内含子4的新突变类型检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计2个探针，而且不能在同一管里检测，成本高，检测难度大。附图说明图1是一例ABCG8基因的内含子4发生完全突变(12902T>C)的测序图。通过MutaionSurveyor分析比对数据，得到如图临床分析报告，可以清楚显示突变位点和突变频率。具体实施方式实施例1抽提血液中的DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。其中，所述10×红细胞裂解液配方为：NH4Cl82g，NaHCO38.4g，EDTA-Na23.72g，加ddH2O定容至1000ml。实施例2PCR扩增：PCR扩增体系试剂配制方法如下：反应条件如下：其中，引物序列为：ABCG8-intron4-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCACCTCTCTAGGGGCTGGTCABCG8-intron4-R：AACAGCTATGACCATGCGGAAGGCAAGCTGAGTTGT。实施例3PCR产物纯化：酶纯化按体系配置如下：CIP(NEB公司)0.1μl，ExoⅠ(NEB公司)0.5μl，去离子水1.4μl；最后加入9μlPCR产物。其纯化反应程序如下：37℃50min，95℃5min。实施例4Sanger测序反应：每反应体系5μl：Bigdye加1μl，3.2P引物加1μl，纯化后的模板加2μl，最后加入1μlddH2O。盖上管盖低速短暂离心，旋涡混匀，再本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测ABCG8内含子4基因突变的引物，其特征在于，包括扩增ABCG8基因内含子4序列的引物，其碱基序列为：ABCG8‑intron4‑F:TGTAAAACGACGGCCAGTCACCTCTCTAGGGGCTGGTCABCG8‑intron4‑R：AACAGCTATGACCATGCGGAAGGCAAGCTGAGTTGT。

【技术特征摘要】
1.检测ABCG8内含子4基因突变的引物，其特征在于，包括扩增ABCG8基因内含子4序列的引物，其碱基序列为：ABCG8-intron4-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCACCTCTCTAGGGGCTGGTCABCG8-intron4-R：AACAGCTATGACCATGCGGAAGGCAAGCTGAGTTGT。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述ABCG8内含子4基因突变包括12902T>C突变点。4.检测ABCG8内含子4基因突变的引物的试剂盒，其特征在于，包括：(i)血液DNA抽提试剂；(ii)检测体系PCR扩增反应液；扩增ABCG8基因内含子4的引物的碱基序列为：ABCG8-intron4-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCACCTCTCTAGGGGCTGGTCABCG8-intron4-R：AACAGCTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑志高，吴鹏飞，王淑一，
申请(专利权)人：合肥艾迪康临床检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34