一种同时无创检测GJB2和SLC26A4基因突变的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种无创检测GJB2和SLC26A4基因突变的方法，试剂盒及其制备方法，其特征在于，包括步骤如下：(1)以受试者血浆DNA为模板；(2)进行PCR预扩增；(3)对预扩增产物进行Index PCR扩增；(4)对PCR扩展产物进行文库质控后，在Illumina NextSeq进行150bp双端测序；(5)将测序的序列信息进行生物信息学分析得出基因变异数据。本发明专利技术还涉及有关的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
一种同时无创检测GJB2和SLC26A4基因突变的方法和试剂盒
本专利技术涉及基因诊断领域，尤其涉及一种无创检测GJB2和SLC26A4基因突变的方法和试剂盒。
技术介绍
基因突变的检测对于可用于鉴别待测样本的基因型是野生型还是突变型。也可以用于检测待测个体的基因状态。比如是否含有导致某些疾病的基因突变。许多种肿瘤检测，胎儿遗传状态检测都具有重要的价值。目前针对胎儿的基因突变筛查，主要基于SNParray等多个平台系统，对胎儿及父母进行全基因组SNP分析，成本昂贵；而常规依赖聚合酶的边合成边测序难以保证碱基准确性，发生的碱基错误造成测序噪声，因此常规文库捕获和高通量测序不能解决由扩增和测序造成的变异检测偏差；而较新的循环单分子扩增和重测序技术(cSMART)技术受其环化文库效率和背靠背引物位点的设计的影响。孕妇外周血中胎儿来源的游离DNA的发现，为无创性检测胎儿遗传状态提供了可能。孕妇外周血cfDNA源于母亲和胎儿，胎儿游离DNA(cffDNA)来源于胎盘滋养层细胞，约占总cfDNA的10-20％，片段长度为140-180bp左右。将cffDNA从母亲来源的DNA中鉴别出来仍然是目前的技术难点，特别是如何检测母血血浆中cffDNA所导致的等位基因比例不平衡。目前国际上对cffDNA的研究主要通过位点特异性PCR，MALDI-TOF质谱法，数字PCR和高通量测序等。目前主流的无创产前检测方法均基于胎儿变异位点检测和单体型检测：通过对母血血浆中cfDNA进行位点检测，然后利用相对变异剂量(RMD)和相对单体型剂量(RHDO)分析孕妇血浆中胎儿变异位点和单体型的相对含量。通过仅存在父亲中的SNP推导了父源部分的胎儿基因组，母亲来源的胎儿基因组部分则使用父亲纯合但母亲杂合的SNP进行推导。Papasavva等利用该方法对母血cfDNA进行分析，成功对其cffDNA基因型和变异位点进行分析。因此利用对cffDNA中变异位点和单体型的检测，可有效地提高胎儿致病基因的诊断准确度。对于遗传性耳聋无创产前基因诊断的方法学研究，目前国际上仅有极少数报道。由于在耳聋热点变异中存在多个Indel变异位点，如GJB2(c.299delAT、c.235delC、c.176_191del16)，不同的平台系统对其cfDNA检测仍然存在多种问题。有必要针对开发一种更便捷和可靠的适合无创检测低拷贝数基因突变的技术。
技术实现思路
因此上述领域存在问题和需求，专利技术人研发了一种快速准确的单分子扩增技术，在常规的多重扩增基础上加入了UMI(UniqueMolecularIdentifier)分子标签，利用UMI对二代测序数据进行降噪，从而准确地检测低拷贝数变异：具体方案如下：一种检测基因突变的方法，包括步骤如下：(1)以受试者血浆DNA为模板；(2)进行PCR预扩增；(3)对预扩增产物进行IndexPCR二次扩增；(4)对PCR二次扩增产物产物进行文库质控，然后在IlluminaNextSeq进行150bp双端测序；(5)将测序的序列中连接接头去掉，然后拼接为一条序列得到原始模板序列；将原始模板序列与人类基因组比对，通过比较原始模板序列的UMI分子标签序列，统计出唯一的模板序列集合；利用唯一的模板序列，计算基因组覆盖，用于评估文库特异性；通过计算突变序列与参照序列的比例统计出检测区域体细胞基因突变率；其特征在于：预扩增中采用的引物是多对引物的混合物，所述多对引物用于特异性扩增待测区域中的不同亚目标区域；所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同,接头序列A与接头序列B之间不相同；所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基因中的不同区域的DNA片段。每一对引物扩增基因中的一个亚目标区域，引物对之间包含的UMI分子标签序列不同，用于保证来源于同一亚目标区域的DNA扩增片段中的UMI分子标签序列相同；而来源于不同亚目标区域的DNA扩增片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同；在所述IndexPCR二次扩增中，所述二次扩增引物的从3’端到5’端依次为接头序列、通用测序接头序列，其中一侧引物在接头序列、通用测序接头序列之间还包含一段Index序；所述二次扩增引物的正向引物和反向引物的3’端分别为所述接头序列A和所述接头序列B的全部或部分；所述Index序列用于标示不同样本，不同的样本采用不同的Index序列，用于同一样本的二次扩增引物采用同一Index序列。上述方法，其特征在于：所述接头序列A、接头序列A的长度为8-15bp，UMI分子标签序列长度为5-8bp上述方法，其特征在于：在进行所述IndexPCR扩增之前，对PCR预扩增所得DNA进行磁珠纯化；上述方法，其特征在于：在进行所述IndexPCR扩增之后，对扩增所得DNA进行磁珠纯化。用于检测基因突变的试剂盒，其特征在于，包含用于特异性预扩增待测区域中的不同亚目标区域的多个引物对；所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同,接头序列A与接头序列B之间不相同；同一来源的DNA片段中的UMI分子标签序列相同；而不同来源的DNA片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同；所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基因中的不同位置区域。上述试剂盒，其特征在于，还包含用于对所述预扩增产物进行扩增的二次扩增引物，所述二次扩增引物的从3’端到5’端依次为接头序列、通用测序接头序列，其中一侧引物在接头序列、通用测序接头序列之间还包含一段Index序；所述二次扩增引物的正向引物和反向引物的3’端分别为所述接头序列A和所述接头序列B的全部或部分；所述Index序列用于标示不同样本，不同的样本采用不同的Index序列，用于同一样本的二次扩增引物采用同一Index序列。上述试剂盒，其特征在于：所述接头序列A、接头序列A的长度为8-15bp，UMI分子标签序列长度为5-7bp。用于检测基因突变的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括合成和/或组装具有以下序列特征的多个引物对，所有的正向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列A、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；所有的反向引物从5’端到3’端依次为含有接头序列B、UMI分子标签序列和亚目标区域特异性引物序列；所有引物对中的接头序列A彼此相同，接头序列B彼此相同,接头序列A与接头序列B之间不相同；同一来源的DNA片段中的UMI分子标签序列相同；而不同来源的DNA片段之间的UMI分子标签序列彼此不相同；所述多个引物对用于特异性预扩增待测区域中的不同亚目标区域；所述待测区域包含1个或几个特定的基因序列区域，所述亚目标区域指一个特定基因中的不同位置区域。上述制备方法，其特征在于，还包含合成和/或组装用于对所述预扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于同时无创检测GJB2和SLC26A4基因突变的试剂盒，其特征在于，包括Seq ID No.1‑98所示的引物构成的49对引物的混合物用于同时特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的不同亚目标区域；从而同时检测GJB2GJB2基因和SLC26A4基因的变异。

【技术特征摘要】
1.用于同时无创检测GJB2和SLC26A4基因突变的试剂盒，其特征在于，包括SeqIDNo.1-98所示的引物构成的49对引物的混合物用于同时特异性扩增GJB2基因和SLC26A4基因的不同亚目标区域；从而同时检测GJB2GJB2基因和SLC26A4基因的变异。2.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含用于对所述预扩增产物进行扩增的二次扩增引物，所述二次扩增引物的正反向引物如SeqIDNo.99和100所示。3.权利要求1或2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括合成和/或组装SeqIDNo.1-98所示核苷酸序列的引物。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包含合成和/或组装用于对所述预扩增产物进行扩增的二次扩增引物，所述二次扩增引物的正反向引物如SeqIDNo.99和100所示。5.一种无创检测GJB2和/或SLC26A4基因突变的方法，包括步骤如下：(1)以受试者血浆DNA为模板；(2)进行PCR预扩增；(3)对预扩增产物进行IndexPCR二次扩增；(4)对PCR二次扩增产物产物进行文库质控，然后在IlluminaNextSeq进行150bp双端测序；(5)将测序的序列中连接接头去掉，然后拼接为一条序列得到原始模板序列，...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁慧军，谭博，程静，卜枫啸，卢宇，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50