一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法技术

本发明专利技术公开的一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，包括以下步骤：步骤1，取待鉴定活血丹的干叶片若干，提取出样品的DNA；步骤2，进行ITS2核苷酸序列的PCR扩增；步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，对测序结果进行序列拼接、注释和比对，得到rDNA ITS2序列；步骤4，基于得到的rDNA ITS2序列，构建系统发育树，鉴定活血丹品种。本发明专利技术鉴定活血丹品种的方法通过改良干药材DNA提取方法和特异性PCR扩增反应条件，为活血丹药材的鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种中药材中准确快速地检测出活血丹及其易混品，提高了检测的准确度，适于广泛推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法
本专利技术属于植物品种鉴定方法
，具体涉及一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法。
技术介绍
活血丹(Glechomalongituba(Nakai)Kupr.)为唇形科多年生草本植物，又名连钱草、地钱儿、遍地金钱、透骨风、过墙风、九里香等，茎高10～20cm、四棱形；叶对生、圆形或肾形；轮伞花序腋生，每轮有花2～6朵；小坚果，果期4～5月。活血丹喜阴湿，生长于林间草地、河畔或田野等地。其干燥地上部分入药，药材名为连钱草(《中国药典》(2010年版)收录)，主产于江苏、浙江一带，性微寒，味辛，入肝、肾、膀胱经，有清热解毒、利尿通淋、散瘀消肿的功能，主治胆囊炎、胆结石、肾结石、黄疸型肝炎等症。活血丹属植物约有8种，广泛分布于欧、亚大陆温带地区，南北美洲有栽培。我国有5种2变种(中国植物志)，即活血丹Glechomalongituba(Nakai)Kupr.，据《中国植物志》记载，活血丹除青海、甘肃、新疆及西藏外，全国各地均产；白透骨消Glechomabiondiana(Diels)C.Y.WuetC.Chen.，分布于陕西、甘肃、河南、河北；欧活血丹GlechomahederaceaL.，在我国产于新疆一带，国外产于北欧、西欧、中欧各国；日本活血丹Glechomagrandis(A.Gray)Kupr.，国内产于江苏、台湾，国外产于日本；大花活血丹GlechomasinograndisC.Y.Wu，别名大筋草，产于云南一带，海拔2000～2900m。变种为无毛白透骨消Glechomabiondiana(Diels)C.Y.WuetC.Chenvar.glabrescensC.Y.Wu&C.Chen，国内分布于甘肃、陕西、河北等省区；狭萼白透骨消G.biondianavar.angustitubaC.Y.WuetC.Chen分布于湖北、四川，海拔1200～1650m。由于活血丹与其同属植物的植株形态相似，传统的形态学手段不能保证基源鉴定的准确性。活血丹及其易混药材的鉴别对于植物资源保护及用药安全都具有重要的意义。随着分子生物学的发展，条形码技术作为一种前沿的分子标记技术应用于多种中药材鉴别上。本专利技术以ITS2序列为条形码，运用生物信息学的方法准确鉴别活血丹及其同属植物，为条形码技术在活血丹鉴定中的应用提供理论及方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，解决了现有鉴定方法准确度低的问题。本专利技术所采用的技术方案是，一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，包括以下步骤：步骤1，取待鉴定活血丹的干叶片若干，提取出待鉴定活血丹样品的DNA；步骤2，基于步骤1得到的DNA，进行ITS2核苷酸序列的PCR扩增，得到PCR产物；步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，对测序结果进行序列拼接、注释和比对，得到rDNAITS2序列；步骤4，基于步骤3得到的rDNAITS2序列，构建系统发育树，鉴定活血丹品种。本专利技术的特征还在于，步骤1具体为：步骤1.1，待鉴定活血丹样品预处理取待鉴定活血丹干叶片3-4片于离心管中，并置于液氮中速冻，随后取出离心管，将待鉴定活血丹干叶片置于含液氮的塑料泡沫容器中，用小木棍碾磨呈粉末状；步骤1.2，待粉末状干叶片的温度回升至室温后，在步骤1.1的塑料泡沫容器中加入550uL的CTAB，置于65℃干浴加热至少30min，加热期间颠倒混匀后放置10min，冷却至室温；步骤1.3，在步骤1.2的溶液中加入450uL的酚氯仿，涡旋振荡，14000rpm条件下离心10min分层，得到上层液体；步骤1.4，吸取450uL步骤1.3的上层液体至离心管，加入与上层液体等体积的氯仿，涡旋振荡，14000rpm条件下离心10min，静置分层得到上清液；步骤1.5，吸取步骤1.4中300uL的上清液至离心管，加入与上清液等体积的预冷至-20℃的异丙醇，上下解倒混匀后，放置于温度-20℃条件下至少10min，随后14000rpm条件下离心10min，静置，去掉上层清液，得到下层白色沉淀；步骤1.6，在步骤1.5的下层白色沉淀中加入500uL预冷至-20℃的体积分数为70％的乙醇，轻弹管壁，悬浮沉淀，14000rpm条件下离心2min，静置分层，再次去掉上层清液，下层沉淀于室温条件下挥发乙醇至干燥；步骤1.7，在步骤1.6干燥的下层沉淀加入80ulTE，于14000rpm条件下离心1min，并于4℃保存，得到待鉴定活血丹样品的DNA，备用。步骤2中PCR扩增的反应体系为：2×TaqPCRMix12.5ul，通用引物ITS2F和ITS3R均选用浓度10umol/L各1ul，步骤1得到的DNA1ul，ddH2O9.5ul。步骤2中PCR扩增的反应条件为：温度94℃，变性2min；温度94℃变性30s，温度56℃退火30s，温度72℃延伸45s，40个循环；温度72℃延伸2min。PCR反应扩增引物为：ITS2F：5’-ATCGATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，ITS2R：5’-ATCGGACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。步骤3中的测序仪具体为ABI3730xlDNAAnalyzer测序仪，步骤3具体操作为：将得到的rDNAITS2序列经Seqman软件拼接校对，随后通过隐马尔科夫模型进行ITS2序列注释。步骤3中rDNAITS2的序列的基因编码如序列1所示。步骤4具体为：将步骤3得到的rDNAITS2序列使用MEGA7.0软件进行数据分析，构建Neighbor-JoiningTree，最后通过对NJ树分析，鉴别活血丹品种。本专利技术的有益效果是：本专利技术一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法通过改良干药材DNA提取方法和特异性PCR扩增反应条件，为活血丹药材的鉴别提供了分子鉴定依据，可从多种中药材中准确快速地检测出活血丹及其易混品，提高了检测的准确度，适于广泛推广应用。附图说明图1是本专利技术一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法中活血丹通用引物ITS2F/3R扩增电泳图，其中从左到右依次为marker条带、陕西红河谷活血丹HHGHXD01、陕西红河谷活血丹HHGHXD02、陕西宁陕县活血丹NSHXD07、陕西宁陕县活血丹NSHXD08、陕西眉县活血丹MXHXD13、陕西眉县活血丹MXHXD14、陕西汉中活血丹HZHXD19、陕西汉中活血丹HZHXD20、control空白阴性对照；DNAmarker条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；图2是本专利技术通过MEGA7.0建立的活血丹及其易混品NeighorJoiningTree图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。1.样品来源，详见表1。表1样品来源2.待测试样品的DNA提取步骤1.1，待鉴定活血丹样品预处理取待鉴定活血丹3片大小相近干叶片于体积1.5mL的离心管中，并置于液氮中速冻，随后取出离心管，将待鉴定活血丹干叶片置于含液氮的塑料泡沫容器中，用小木棍碾磨呈粉末状；步骤1.2，待粉末状干叶片的温度回升至室温后，在步骤1.1的塑料泡沫容器中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，取待鉴定活血丹的干叶片若干，提取出待鉴定活血丹样品的DNA；步骤2，基于步骤1得到的DNA，进行ITS2核苷酸序列的PCR扩增，得到PCR产物；步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，对测序结果进行序列拼接、注释和比对，得到rDNAITS2序列；步骤4，基于步骤3得到的rDNAITS2序列，构建系统发育树，鉴定活血丹品种。

【技术特征摘要】
1.一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，取待鉴定活血丹的干叶片若干，提取出待鉴定活血丹样品的DNA；步骤2，基于步骤1得到的DNA，进行ITS2核苷酸序列的PCR扩增，得到PCR产物；步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，对测序结果进行序列拼接、注释和比对，得到rDNAITS2序列；步骤4，基于步骤3得到的rDNAITS2序列，构建系统发育树，鉴定活血丹品种。2.根据权利要求1所述的一种利用ITS2序列鉴定活血丹品种的方法，其特征在于，所述步骤1具体为：步骤1.1，待鉴定活血丹样品预处理取待鉴定活血丹干叶片3-4片于离心管中，并置于液氮中速冻，随后取出离心管，将待鉴定活血丹干叶片置于含液氮的塑料泡沫容器中，用小木棍碾磨呈粉末状；步骤1.2，待粉末状干叶片的温度回升至室温后，在步骤1.1的塑料泡沫容器中加入550uL的CTAB，置于65℃干浴加热至少30min，加热期间颠倒混匀后放置10min，冷却至室温；步骤1.3，在步骤1.2的溶液中加入450uL的酚氯仿，涡旋振荡，14000rpm条件下离心10min分层，得到上层液体；步骤1.4，吸取450uL步骤1.3的上层液体至离心管，加入与上层液体等体积的氯仿，涡旋振荡，14000rpm条件下离心10min，静置分层得到上清液；步骤1.5，吸取步骤1.4中300uL的上清液至离心管，加入与上清液等体积的预冷至-20℃的异丙醇，上下解倒混匀后，放置于温度-20℃条件下至少10min，随后14000rpm条件下离心10min，静置，去掉上层清液，得到下层白色沉淀；步骤1.6，在步骤1.5的下层白色沉淀中加入500uL预冷至-20℃的体积分数为70％的乙醇，轻弹管壁，悬浮沉淀，14000rpm条件下离心2min，静置分层，再次去掉上层清液，下层沉淀于室...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑梦迪，张彦，张寒，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61