一种焦磷酸测序法检测肠促胰素作用相关的单核苷酸多态性的试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种焦磷酸测序法检测肠促胰素作用相关基因的单核苷酸多态性的试剂盒及方法，所述的试剂盒包括用于测定多态性位点rs3765467、多态性位点rs10423928、多态性位点rs7903146、多态性位点rs4664443、多态性位点rs12617656的上游引物、下游引物和测序引物，其具体序列参见SEQ ID NO.1～15。本发明专利技术通过选择与肠促胰素作用相关基因的特定的5个单核苷酸多态性位点并对该些多态性位点的引物设计以及PCR扩增体系和条件的优化，使得本发明专利技术具有很高的特异性，可以成功将5个多态性位点进行分型，对二肽基肽酶4(DPP‑4)抑制剂的临床个体化用药具有潜在指导意义。

【技术实现步骤摘要】
一种焦磷酸测序法检测肠促胰素作用相关的单核苷酸多态性的试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测肠促胰素作用相关的单核苷酸多态性的试剂盒及方法。
技术介绍
在健康者中，肠促胰素效应负责大约70％的餐后胰岛素分泌[1]，对正常机体的血糖调节过程起着重要作用，GIP和GLP-1作为两种主要的肠促胰素，主要由肠内分泌K细胞和L细胞分泌[2]，它们在分泌后1～2min内即可被二肽基肽酶4(DPP-4)降解失活，DPP-4抑制剂通过抑制DPP-4对活性肠促胰素的水解作用，增加活性肠促胰素的水平而改善血糖控制，是治疗2型糖尿病(T2DM)的新靶点。然而临床使用过程中发现，DPP-4抑制剂的疗效个体间差异很大，目前为止，决定DPP-4抑制剂治疗反应的因素未能完全阐明，基因组学研究显示，不同个体的基因存在0.1％的差异，由此推断遗传因素可能是影响DPP-4抑制剂疗效的关键因素。研究发现，T2DM患者普遍存在肠促胰素效应减弱，可能原因包括肠促胰素分泌减少、DPP-4降解肠促胰素活性升高以及肠促胰素受体信号转导通路受损等，因此参与肠促胰素合成、降解和作用通路的相关基因的遗传变异成为研究DPP-4抑制剂疗效差异的靶点。在肠促胰素合成通路中，转录因子7类似物2(TCF7L2)起着重要的作用，截止到目前为止，TCF7L2是被大量欧洲人群证实与T2DM的发生最密切的易感基因，其中rs7903146位点被认为与T2DM发生相关度最高[3]，rs7903146的T风险等位基因携带者肠促胰素效应降低[4-5]，使用DPP-4抑制剂利格列汀后，rs7903146的CC和TT组患者HbA1c的降低有显著性差异[6]，因此进一步研究rs7903146在中国苏南地区的基因型分布及其对DPP-4抑制剂疗效的影响具有显著的临床意义。生理性分泌的肠促胰素在体内迅速被DPP-4降解失活，抑制DPP-4的酶活性可延长体内肠促胰素在循环血液中的水平和它们的作用时间，从而调节胰岛细胞分泌的胰岛素和胰高血糖素水平。DPP-4的rs12617656和rs4664443位点的多态性与T2DM相关，并且rs4664443与血清DPP-4水平相关[7]，因此进一步探讨DPP-4的rs12617656和rs4664443位点的多态性是否影响患者的肠促胰素效应从而影响DPP-4抑制剂的疗效具有临床意义。另有研究者提出，在T2DM患者中，肠促胰素分泌是正常的，而其促进胰岛素分泌的效应下降了30％～70％，因此猜测肠促胰素抵抗可能是致胰岛素分泌下降的另一机制，因此编码肠促胰素受体GLP-1R和GIPR的基因成为研究肠促胰素抵抗和DPP-4抑制剂疗效差异的候选基因。EugeneHan等对246位韩国T2DM患者的研究提示GLP-1R的rs3765467变异与DPP-4抑制剂疗效相关[8]。SaxenaR等进行的meta分析显示GIPR的rs10423928变异与胰岛素分泌减少和肠促胰素效应降低相关[9]。因此拟对GLP-1R的rs3765467位点和GIPR的rs10423928位点的多态性对DPP-4抑制剂疗效的影响作进一步的探讨。与血糖调节通路相关的基因多态性是目前糖尿病遗传学研究较为深入的领域，但与DPP-4抑制剂疗效相关的研究较少且研究结果不一；寻找确切影响DPP-4抑制剂疗效的SNP位点进行深入研究，有助于临床寻找合适的患者进行针对性的治疗，减少不必要的药物消耗；因此申请人认为深入研究影响DPP-4抑制剂疗效的遗传因素如单核苷酸多态性对临床糖尿病的治疗具有重要的指导意义。目前，临床还没有针对以上所述的5个多态性位点进行检测的方法。焦磷酸测序是一种新型的酶联级联测序技术，该技术具有可重复性好，精确度高，操作简单、快捷的优势。本专利技术是基于焦磷酸测序技术进行的肠促胰素作用相关基因的5个单核苷酸突变位点的检测方法的开发和应用。参考文献[1]NauckM,StkmannF,EbertRetal.ReducedincretineffectinType2(non-insulin-dependent)diabetes.Diabetologia.1986；29(1):46-52.[2]GromadaJ，Dissings，BokristKeta1.G1ucagorl-1ikepeptide1increasecytoplasmiccalciumininsulin-secretingβTC3-cellsbyenhancementofintracellurcalciummobilization.Diabetes.1995；44:767-774.[3]CauchiS,ElAchhabY,ChoquetHetal.TCF7L2isreproduciblyassociatedwithtype2diabetesinvariousethnicgroups:aglobalmeta-analysis.JMolMed(Berl).2007；85:777-782.[4]LyssenkoV,LupiR,MarchettiPetal.MechanismsbywhichcommonvariantsintheTCF7L2geneincreaseriskofType2diabetes.J.Clin.Invest.2007；117(8):2155-2163.[5]VillarealDT,RobertsonH,BellGIetal.TCF7L2variantrs7903146affectstheriskofType2diabetesbymodulatingincretinaction.Diabetes.2010；59(2):479-485.[6]ZimdahlH,IttrichC,Graefe-ModyUetal.InfluenceofTCF7L2genevariantsonthetherapeuticresponsetothedipeptidylpeptidase-4inhibitorlinagliptin.Diabetologia.2014；57(9):1869-1875.[7]AhmedRH,HuriHZ,Al-HamodiZetal.AssociationofDPP4GenePolymorphismswithType2DiabetesMellitusinMalaysianSubjects.PLoSOne.2016；11(4):e0154369.[8]EugeneHan,HyeSunPark,ObinKwon,etal.AgeneticvariantinGLP1RisassociatedwithresponsetoDPP-4inhibitorsinpatientswithtype2diabetes.Medicine(Baltimore).2016；95(44):e5155.[9]SaxenaR,HivertMF,LangenbergCetal.GeneticvariationinGIPRinfluencestheglucoseandinsulinresponsestoanoralglucosechallenge.Nat.Genet.2010；42(2):142–148.专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种焦磷酸测序法检测肠促胰素作用相关基因的单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括用于测定多态性位点rs3765467的上游引物、下游引物和测序引物，用于测定多态性位点rs10423928的上游引物、下游引物和测序引物，用于测定多态性位点rs7903146的上游引物、下游引物和测序引物，用于测定多态性位点rs4664443的上游引物、下游引物和测序引物，用于测定多态性位点rs12617656的上游引物、下游引物和测序引物，其中：所述的多态性位点rs3765467的上游引物序列为：CCCGCCTCAACTCACTCTTTC，下游引物序列为：ACGTGTACCGGTTCTGCACAG，测序引物序列为：GCGAGGAGTCCAAGC；所述的多态性位点rs10423928的上游引物序列为：GGGGAAAATACTAGTCTCAGTGGA，下游引物序列为：GGTTCTTGGCTGTATTCCTGTGA，测序引物序列为：GCTGAATTTAATGAATGAAC；所述的多态性位点rs7903146的上游引物序列为：TGGGCTTTCTCTGCCTCAAAAC，下游引物序列为：ACTTGCCTTCCCTGTAACTGTGGT，测序引物序列为：AGCTAAGCACTTTTTAGAT；所述的多态性位点rs4664443的上游引物序列为：TGAATCACCCGAGGAAGCG，下游引物序列为：TCTCATCCCACCCATTCCTCTC，测序引物序列为：TCACCCGAGGAAGCG；所述的多态性位点rs12617656的上游引物序列为：TGAGCTATTATCATGCTGGTTTCA，下游引物序列为：TAGCGAGTTTGGGGTTAAGAAG，测序引物序列为：CAGTAAATGTGTGGCAGA。...

【技术特征摘要】
1.一种焦磷酸测序法检测肠促胰素作用相关基因的单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括用于测定多态性位点rs3765467的上游引物、下游引物和测序引物，用于测定多态性位点rs10423928的上游引物、下游引物和测序引物，用于测定多态性位点rs7903146的上游引物、下游引物和测序引物，用于测定多态性位点rs4664443的上游引物、下游引物和测序引物，用于测定多态性位点rs12617656的上游引物、下游引物和测序引物，其中：所述的多态性位点rs3765467的上游引物序列为：CCCGCCTCAACTCACTCTTTC，下游引物序列为：ACGTGTACCGGTTCTGCACAG，测序引物序列为：GCGAGGAGTCCAAGC；所述的多态性位点rs10423928的上游引物序列为：GGGGAAAATACTAGTCTCAGTGGA，下游引物序列为：GGTTCTTGGCTGTATTCCTGTGA，测序引物序列为：GCTGAATTTAATGAATGAAC；所述的多态性位点rs7903146的上游引物序列为：TGGGCTTTCTCTGCCTCAAAAC，下游引物序列为：ACTTGCCTTCCCTGTAACTGTGGT，测序引物序列为：AGCTAAGCACTTTTTAGAT；所述的多态性位点rs4664443的上游引物序列为：TGAATCACCCGAGGAAGCG，下游引物序列为：TCTCATCCCACCCATTCCTCTC，测序引物序列为：TCACCCGAGGAAGCG；所述的多态性位点rs12617656的上游引物序列为：TGAGCTATTATCATGCTGGTTTCA，下游引物序列为：TAGCGAGTTTGGGGTTAAGAAG，测序引物序列为：CAGTAAATGTGTGGCAGA。2.根据权利要求1所述的焦磷酸测序法检测肠促胰素作用相关基因的单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于：所述的多态性位点rs3765467的上游引物或下游引物采用生物素标记；所述的多态性位点rs10423928的上游引物或下游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：施爱明，钱晨月，鲍君杰，
申请(专利权)人：苏州大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32