一步法RT-PCR预混试剂制造技术

本发明专利技术提供一种一步法RT‑PCR预混试剂，其特征在于，包括：RNA转录为cDNA的试剂，以及多聚糖。本发明专利技术将RT‑PCR反应所需酶、缓冲液等试剂预混在一个反应管中，节省了RT‑PCR操作时间，并且减少了反复开盖可能带来的污染。进一步，本发明专利技术通过添加多聚糖等试剂，增强了RT‑PCR反应效率。

【技术实现步骤摘要】
一步法RT-PCR预混试剂
本专利技术涉及一种一步法RT-PCR预混试剂，属于分子生物学领域。
技术介绍
反转录PCR(RT-PCR)以RNA为模板进行扩增，在基因表达水平的检测、RNA病毒含量检测以及直接克隆特定基因cDNA等方面有着广泛的应用。反转录PCR分为两个步骤，首先在反转录酶的作用下将RNA反转录为单链的cDNA，然后在DNA聚合酶的作用下将单链cDNA扩增为双链的DNA分子。RT-PCR过程可以分步进行，即在转录完成后去除酶、金属离子等对DNA聚合酶有抑制的组分，再加入DNA聚合酶和对应的缓冲溶液，也可以将反转录酶和DNA聚合酶混入一管中进行一步反应。同两步反应相比，一步反应降低了反复开盖带来的风险，因而更加便捷和安全。要实现一步RT-PCR反应并不容易，一系列报道显示当反转录酶和DNA聚合酶在一管中进行反应时会相互干扰，引起RT-PCR灵敏度的降低。一方面这种抑制来自于反转录酶和DNA聚合酶最优缓冲液的不一致，另一方面多篇报道指出诸如鸟类成髓细胞白血病病毒反转录酶(AMV-RT)和小鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV-RT)等会抑制DNA聚合酶的活力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的一步法RT-PCR预混试剂，以增强一步法RT-PCR的反应效率。本专利技术采用了如下技术方案：一种一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于，包括：RNA转录为cDNA的试剂，以及多聚糖。进一步，本专利技术的一步法RT-PCR预混试剂：其中，RNA转录为cDNA的试剂包括：反转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、辅因子以及表面活性剂。优选的，本专利技术的一步法RT-PCR预混试剂，还具有这样的特征：其中，RNA转录为cDNA的试剂包括：反转录酶：M-MLV-RT或者AMV-RT，一种或者两种DNA聚合酶，5-100mM的Tris-HCl或者Tris-SO4，1～10mM的MgCl2，10～200mM的KCl，200～400μM的dNTP，5～40mM的DTT，10～400mM的海藻糖，0.2～3mg/mL的BSA，20～50mM的硫酸盐，甘油5～35％。优选的，本专利技术的一步法RT-PCR预混试剂，还包括：SYBR染料，用以染料法RT-PCR过程。优选的，本专利技术的一步法RT-PCR预混试剂，其中，硫酸盐为硫酸铵。优选的，本专利技术的一步法RT-PCR预混试剂，其中，多聚糖为：水溶性葡聚糖。优选的，本专利技术的一步法RT-PCR预混试剂，其中，水溶性葡聚糖的浓度范围是10-25mM。优选的，本专利技术的一步法RT-PCR预混试剂，其中，水溶性葡聚糖的浓度是20mM。优选的，本专利技术的一步法RT-PCR预混试剂，预混试剂的pH范围是8.3～9.2。本专利技术还提供上述任意一项的一步法RT-PCR预混试剂在制备核酸检测试剂盒中的应用。专利技术的有益效果第一，将RT-PCR反应所需酶、缓冲液等试剂预混在一个反应管中，节省了RT-PCR操作时间，并且减少了反复开盖可能带来的污染。第二，通过添加多聚糖等试剂，增强了RT-PCR反应效率。附图说明图1是添加水溶性葡聚糖的RT-PCR扩增曲线。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的技术方案做详细的说明。实施例1：Tris-HCl和Tris-SO4对RT-PCR的影响为了考察不同pH的Tris-HCl和Tris-SO4对一步法RT-PCR的影响，以GAPDH基因为例进行试验，分别加入Tris-HCl或者Tris-SO4配制了5个梯度pH的预混试剂。本实施方式中其他组分及浓度为：硫酸铵20mM、KCl50mM、占预混试剂总质量15％的甘油、dNTP300μM、海藻糖300mM、DTT20mM、BSA0.4mg/mL。常规浓度的AMV-RT和DNA聚合酶。RT-PCR反应条件：42℃或者50℃反转录5min，95℃变性10s；95℃预变性5s，60℃扩增20s，40个循环反应。从表1可知，Tris-HCl和Tris-SO4的最优pH浓度为8.8，且Tris-HCl更有利于RT-PCR过程，这可能是我们配制的buffer中已经有了适宜浓度的硫酸根离子，再加入更多的硫酸根离子反而不利于RT-PCR反应。各实施方式中反转录酶M-MLV-RT和DNA聚合酶的浓度采用常规浓度即可。表1.不同pH的Tris-HCl和Tris-SO4对RT-PCR的影响+，表示促进RT-PCR过程且加号越多促进作用越明显；-，表示抑制RT-PCR过程实施例2：添加水溶性葡聚糖Ficoll400(Sigma-aldrich)对RT-PCR的影响。各实施方式中的水溶性葡聚糖均指来自Sigma-aldrich的Ficoll400葡聚糖。本实施方式中其他组分及浓度为：硫酸铵20mM、KCl50mM、占预混试剂总质量15％的甘油、dNTPμM、海藻糖300mM、DTT20mM、BSA2mg/mL。pH浓度调节至8.8。常规浓度的AMV-RT和DNA聚合酶。RT-PCR反应条件：42℃或者50℃反转5min，95℃变性10s；95℃预变性5s，60摄氏度扩增20s，40个循环反应。添加水溶性葡聚糖，考察了不同浓度水溶性葡聚糖对RT-PCR的影响。从表2可知，随着葡聚糖浓度的增加RT-PCR效果呈现先增加后降低的趋势，当其浓度为20mM时，RT-PCR效果最好，而当浓度过高时促进作用减弱。在水溶性葡聚糖浓度为20mM时用不同RNA模板浓度进行试验，同不添加葡聚糖的组分比较。从附图1可知，添加适宜的水溶性葡聚糖对RT-PCR促进效果明显，显著提升了样品Ct值。图1中带星号的曲线是未加水溶性葡聚糖的曲线，不带星号的曲线是加入不同浓度水溶性葡聚糖的曲线。表2.不同浓度水溶性葡聚糖对RT-PCR的影响+，表示促进RT-PCR过程且加号越多促进作用越明显；-，表示抑制RT-PCR过程实施例3：本实施方式中的一步法RT-PCR预混试剂包括：反转录酶：M-MLV-RT，DNA聚合酶，5mM的Tris-HCl和5mM的Tris-SO4，1mM的MgCl2，10mM的KCl，200μM的dNTP，5mM的DTT，10mM的海藻糖，1mg/mL的BSA，20mM的硫酸铵，占总质量5％的甘油。10mM的水溶性葡聚糖Ficoll400。将pH值调节到8.3。RT-PCR反应条件：42℃或者50℃反转5min，95℃变性10s；95℃预变性5s，60摄氏度扩增20s，40个循环反应。实施例4：反转录酶：AMV-RT，DNA聚合酶，100mM的Tris-HCl，10mM的MgCl2，200mM的KCl，400μM的dNTP，40mM的DTT，400mM的海藻糖，1.8mg/mL的BSA，50mM的硫酸铵，占预混试剂总质量15％的甘油。25mM的水溶性葡聚糖Ficoll400。将pH值调节到9.2。RT-PCR反应条件：42℃或者50℃反转5min，95℃变性10s；95℃预变性5s，60摄氏度扩增20s，40个循环反应。实施例5：添加不同BSA对实验结果的影响。本实施方式中各组分及浓度为：硫酸铵20mM、KCl50mM、占预混试剂总质量15％的甘油、dNTPμM、海藻糖300mM、DTT20mM、BSA0.4mg/mL。pH浓度调节至8.8。常规浓度的AMV-RT和DNA聚合酶。RT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种一步法RT‑PCR预混试剂，其特征在于，包括：RNA转录为cDNA的试剂，以及多聚糖。

【技术特征摘要】
1.一种一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于，包括：RNA转录为cDNA的试剂，以及多聚糖。2.如权利要求1所述的一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于：其中，所述RNA转录为cDNA的试剂包括：反转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、辅因子以及表面活性剂。3.如权利要求1所述的一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于：其中，所述RNA转录为cDNA的试剂包括：反转录酶：M-MLV-RT或者AMV-RT，一种或者两种DNA聚合酶，5-100mM的Tris-HCl或者Tris-SO4，1～10mM的MgCl2，10～200mM的KCl，200～400μM的dNTP，5～40mM的DTT，10～400mM的海藻糖，0.2～3mg/mL的BSA，20～50mM的硫酸盐，甘油5～35...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31