一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测体系。这一方法是基于ABI QuantStudio™3D数字PCR系统对EGFR基因Exon19缺失进行突变检测。本发明专利技术利用MGB探针特异性的区分野生型和突变型的样本，能够同时在低丰度和低灵敏度的样本中得到很好的检测结果，实验可重复性能好，误差小，是检测低丰度地突变比例的优势技术。

【技术实现步骤摘要】
一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法
本专利技术涉及生物检测方法
，具体涉及一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法。
技术介绍
自从PCR技术在20世纪80年代被专利技术以来，这一方法已经成为生命科学研究领域中最基础和最常规的实验方法之一。第一代传统的PCR技术采用琼脂糖凝胶电泳的方法来对PCR产物进行分析，但这一方法主要适用于定性和半定量研究。在2()世纪9()年代初出现了第二代的定量PCR(quantitativePCR，qPCR)技术，通过在反应方法中加入荧光染料，检测反应中发出的荧光信号达到阈值的循环数即循环阈值(cyclethreshold，Ct)来计算目的酸序列的含量。qPCR技术因其快速、简易和经济的特点，目前仍被各实验室广泛地使用。但qPCR技术所谓的“定量”仍然是相对的，依赖于Ct值和标准曲线。qPCR在目的序列含量低、表达量差异十分微小、反应方法中含大量背景序列或抑制物等情况下，灵敏度和精确度都受到很大限制。在这种背景下，第三代PCR——数字PCR(digitalPCR，dPCR)应运而生了。数字PCR的原理为dPCR把反应方法均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，目的核酸序列的数量符合泊松分布。然后在每个反应单元中独立地进行PCR扩增。扩增结束后，检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占所有反应单元的比例来计算目的核酸序列的拷贝数。在dPCR反应中荧光信号的产生过程基本与qPCR相同。dPCR技术qPCR技术有着以下的优势：(1)高灵敏度。dPCR本质上将一个传统的PCR反应变成了数万个PCR反应，在这数万个反应单元中分别独立检测目的序列，从而大大提高了检测的灵敏度。(2)高精确度。dPCR通过计算在数万个反应单元中阳性反应单元数量和比例，可以精确地检测出变化很小的目的序列差异。(3)高耐受性。dPCR技术第一步反应方法分配的过程，可以使背景序列和PCR反应抑制物被均匀分配到每个反应单元，而大部分反应单元中并不含有目的序列，低丰度的目的序列被相对富集于某些反应单元中，从而显著地降低了这些反应单元中背景序列和抑制物对反应的干扰。另外，dPCR在对每个反应单元进行结果判读时仅判断阳性／阴性两种状态，不依赖于Ct值，受扩增效率的影响大为降低，对背景序列和抑制物的耐受能力也大大提高。(4)绝对定量。PCR直接计算目的序列的拷贝数，无需依赖于ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor，简称为EGFR、ErbB-1或HER1)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR分为三区:胞外配体结合区，跨膜区和胞内激酶区。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。其可能机制有：EGFR的高表达引起下游信号传导的增强；突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化；自分泌环的作用增强；受体下调机制的破坏；异常信号传导通路的激活等。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR的高表达主要与其基因扩增有关。但有时EGFR表达水平的调节异常也存在于翻译及翻译后。EGFR在肿瘤中的高表达还可能与活化后降解减少有关，一些研究指出c-Src可通过抑制受体泛素化和内吞作用而上调EGFR水平。许多肿瘤中有突变型EGFR存在，现已发现许多种EGFR突变型。突变型EGFR的作用可能包括：具有配体非依赖型受体的细胞持续活化；由于EGFR的某些结构域缺失而导致受体下调机制的破坏、异常信号传导通路的激活、细胞凋亡的抑制等。突变体的产生是由于EGFR基因的缺失、突变和重排。EGFR的配体对细胞内信号传导有很大影响。EGFR的配体通过自分泌形式激活EGFR促进细胞增殖，他们的共表达往往预示肿瘤预后不良，例如，在乳腺浸润性导管癌的研究中发现，TGFα与EGFR共表达，且这种共表达与病人的生存率显著相关。Kopp等人对结/直肠癌的研究表明肿瘤的自分泌生长是EGFR的过表达及其配体表达共同作用的结果。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题和需求，本专利技术的目的是提供一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，应用数字PCR平台的低丰度检出率、高灵敏度、高特异性的优势，提高对基因突变位点的检出性能，以便更好的满足科研及临床的要求。技术方案：为了实现上述目的，本专利技术提供一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法：所述检测方法包括如下步骤：（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、EGFR基因Exon19位点正向和反向扩增引物、EGFR基因Exon19缺失位点标记TaqMan探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；（2）制备数字PCR反应芯片；（3）进行数字PCR扩增程序；（4）进行PCR芯片荧光信号读取；（5）数据分析和结果统计。优选地，所述步骤（1）中设计的EGFR基因Exon19缺失位点正向和反向扩增引物包括用于扩增POLE基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQIDNos：1和一条反向引物SEQIDNos：2，正向引物SEQIDNos：1的序列为：CAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTC，反向引物SEQIDNos：2的序列为：CATCGAGGATTTCCTTGTTG。优选地，所述步骤（1）中EGFR基因Exon19缺失位点标记TaqMan探针包含两条可以特异性杂交EGFR基因Exon19缺失区域的探针SEQIDNos：3和SEQIDNos：4，探针SEQIDNos：3特异性杂交野生型扩增产物，SEQIDNos：3的序列为：GCTTCTCTTAATTCCT；探针SEQIDNos：4特异性杂交突变型扩增产物，SEQIDNos：4的序列为：GCTATCAAAACATCT。优选地，所述步骤（1）中设计的内参基因正向和反向扩增引物包括用于扩增内参基因B2M的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQIDNos：5和一条反向引物SEQIDNos：6，正向引物SEQIDNos：5的序列为：CACTGAATTCACCCCCACTG，反向引物SEQIDNos：6的序列为：AAGCAGAATTTGGAATTCATCC。优选地，所述步骤（1）中的内参基因标记TaqMan探针包含一条可以特异性杂交内参基因B2M扩增区域的探针SEQIDNos：7，探针SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、EGFR基因Exon19位点正向和反向扩增引物、EGFR基因Exon19缺失位点标记TaqMan 探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR 反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；（2）制备数字PCR反应芯片；（3）进行数字PCR扩增程序；（4）进行PCR芯片荧光信号读取；（5）数据分析和结果统计。

【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、EGFR基因Exon19位点正向和反向扩增引物、EGFR基因Exon19缺失位点标记TaqMan探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；（2）制备数字PCR反应芯片；（3）进行数字PCR扩增程序；（4）进行PCR芯片荧光信号读取；（5）数据分析和结果统计。2.根据权利要求1所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中设计的EGFR基因Exon19缺失位点正向和反向扩增引物包括用于扩增POLE基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQIDNos：1和一条反向引物SEQIDNos：2，正向引物SEQIDNos：1的序列为：CAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTC，反向引物SEQIDNos：2的序列为：CATCGAGGATTTCCTTGTTG。3.根据权利要求1所述的基于数字PCR平台EGFR基因Exon19缺失突变的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中EGFR基因Exon19缺失位点标记TaqMan探针包含两条可以特异性杂交EGFR基因Exon19缺失区域的探针SEQIDNos：3和SEQIDNos：4，探针SEQIDNos：3特异性杂交野生型扩增产物，SEQIDNos：3的序列为：GCTTCTCTTAATTCCT；探针SEQIDNos：4特异性杂交突变型扩增产物，SEQIDNos：4的序列为：GCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽英，
申请(专利权)人：张丽英，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15