基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法技术

本发明专利技术提供了一种缺失突变基因的荧光检测试剂盒，所述试剂盒包括：PNA捕获探针；DNA探针；锁式探针；DNA聚合酶；DNA连接酶；滚环扩增引物；荧光探针。本发明专利技术还提供了使用所述的试剂盒进行缺失突变基因荧光检测的方法，所述方法包括以下步骤：1)将所述PNA捕获探针固定在孔板底部，后在缓冲液条件下与靶基因杂交；2)使被固定在孔板底部的靶基因与DNA探针杂交；3)使与靶基因杂交后的DNA探针上的单链部分与锁式探针杂交，并使用连接酶进行环化，在滚环扩增引物和DNA聚合酶的作用下进行滚环扩增；4)使荧光探针与滚环扩增产物杂交，淬灭背景荧光后检测荧光强度的变化。

【技术实现步骤摘要】
基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法
本申请涉及一种基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法，属于化学和生物传感

技术介绍
基因序列缺失突变是由于DNA分子中发生碱基对的缺失引起的基因结构改变，是基因突变中的一种，人体中的基因缺失往往诱发多种疾病，如表皮生长因子(EGFR)的18-21号外显子发生基因缺失，诱发肺癌尤其是非小细胞肺癌的产生。伴随着疾病的发生发展，人体病变组织或者血液中缺失突变基因成为临床疾病快速、精确诊断的重要生理指标。目前，qRT-PCR(定量逆转录聚合酶链式反应)和第二代基因测序技术是针对缺失突变基因主要的检测方法。qRT-PCR技术可以实现几个DNA分子的扩增，具有很高的灵敏度和专一性，然而主要缺陷在于反应过程需要精确控温，实验条件要求较高，不适合现场使用；第二代基因测序技术需要专业且昂贵的设备进行数据采集和解析，从而限制其广泛应用。滚环扩增(RollingCircleAmplification，RCA)是现阶段应用最广泛的恒温扩增技术之一，以环形DNA为模板，以寡聚核苷酸(与部分环状模板互补)为引物，在有链置换作用的DNA聚合酶(如phi29DNApolymerase)作用下，引物延伸一个循环至起始延伸处置换下旧的DNA链而继续进行下一个循环，如此多次循环，生成含有大量重复序列的DNA长链。滚环扩增凭借其高特异性、高灵敏度和易操作等性质被大量应用于免疫芯片检测、细胞原位检测、全基因组DNA检测、单核苷酸多态性检测等多种领域中。本专利技术结合滚环扩增技术、氧化石墨烯荧光淬灭技术和荧光检测法，设计一个针对缺失突变基因的检测体系，其检测限达到1pM，与其他检测缺失突变基因的检测方法相比，具有高灵敏度、高特异性、操作简便、快速的特点。
技术实现思路
根据本申请的一个方面，提供一种缺失突变基因的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：PNA捕获探针、DNA探针、锁式探针、DNA聚合酶、滚环扩增引物和荧光探针。优选地，所述PNA捕获探针是与靶基因缺失突变位点附近靠近3’端的10至25个碱基序列完全互补的PNA序列，所述PNA序列的羧基端与靶基因5’端碱基互补，所述PNA序列的氨基端与靶基因3’端碱基互补。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述的PNA捕获探针羧基端(CONH2)连接1-5个聚乙二醇单甲醚(mPEG)单体以增加水溶性。优选地，所述DNA探针是与靶基因缺失突变位点两端部分序列完全互补的DNA序列；其中，所述DNA探针与靶基因杂交时，与靶基因缺失突变位点处对应的部分是以单链形式存在的单链区。本专利技术中的DNA探针与正常基因杂交形成完全互补的DNA双链，而与缺失突变基因杂交时，DNA探针中间部分不结合，以单链形式存在。优选地，所述锁式探针的5’端和3’端与所述DNA探针的单链区完全互补，所述锁式探针的5’端和3’端的与所述DNA探针单链区的连接点位于所述DNA探针单链区的中心。优选地，所述DNA聚合酶和所述滚环扩增引物能够对由所述锁式探针和所述DNA探针单链区组成的环状DNA进行滚环扩增。所述锁式探针和所述DNA探针单链区在DNA连接酶的作用下能够形成环状的DNA，以进行后续的滚环扩增。优选地，所述荧光探针是带有荧光标记的DNA信号探针，所述荧光探针能够与所述环状DNA的滚环扩增产物上的重复片段序列结合。优选地，所述DNA连接酶选自E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶中的至少一种；更优选为T4DNA连接酶。所述DNA聚合酶选自phi29DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I中的至少一种；更优选为phi29DNA聚合酶。所述滚环扩增引物选自与环状DNA互补配对碱基序列中的至少15个以上碱基。根据本专利技术的另一个方面提供使用所述试剂盒进行基因缺失突变荧光检测的方法，所述方法包括以下步骤：1)将所述PNA捕获探针固定在孔板底部，后在缓冲液条件下与靶基因杂交；2)使被固定在孔板底部的靶基因与DNA探针杂交；3)使与靶基因杂交后的DNA探针上的单链部分与锁式探针杂交，并使用连接酶进行环化，在滚环扩增引物和DNA聚合酶的作用下进行滚环扩增；4)使荧光探针与滚环扩增产物杂交，淬灭背景荧光后检测荧光强度的变化。优选地，所述步骤1)中固定PNA捕获探针的方法包括，向孔板加入PNA探针和固定液，室温震荡孵育1.5-2.5小时，加入屏蔽液，继续震荡孵育20-40分钟，用缓冲液清洗后加入PBS密封保存备用。PNA捕获探针固定的孔板包括96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板，孔板底部带有活性羧基，在碱性条件下能与氨基反应形成酰胺键。在本专利技术的一个优选实施方式中，孵育后分别采用PBST和PBS溶液清洗3次，再加入PBS缓冲液进行保存。优选地，所述固定液选自碳酸氢钠固定液、碳酸钠固定液、碳酸氢钾固定液、碳酸钾固定液中的至少一种，所述屏蔽液选自赖氨酸屏蔽液、精氨酸屏蔽液、天冬酰胺屏蔽液、谷氨酰胺屏蔽液中的至少一种，所述PNA探针的浓度为80-120μM，PNA探针和固定液的体积比为1：(80-120)。优选地，所述步骤1)中，PNA捕获探针与靶基因杂交的方法包括，加入阻断液后在室温下震荡孵育20-40分钟，使用缓冲液清洗后加入不同浓度的靶基因，继续震荡孵育后使用缓冲液清洗。本专利技术中，使用缓冲液清洗后加入的靶基因，浓度可以包括1fM-100nM。优选地，所述阻断液选自小牛胸腺DNA或鲑鱼精DNA的BLBs，更优选含有鲑鱼精DNA的BLBs阻断液。优选地，所述步骤3)中，环化的方法包括，加入DNA连接酶、连接缓冲液和双蒸水在35-40℃的条件下孵育1-2小时后，再于55-65℃的条件下孵育15-25分钟使所述DNA连接酶失活。优选地，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶，所述DNA连接酶的浓度为5-9U/μL，所述连接酶缓冲液是10×T4DNA连接缓冲液，所述DNA连接酶、连接缓冲液和双蒸水的加入体积比为2：(2-4)：(24-26)。优选地，所述步骤3)中滚环扩增的方法包括，加入滚环扩增引物、DNA聚合酶、聚合缓冲液、牛血清白蛋白、dNTP和双蒸水，在35-40℃下孵育0.5-1.5小时，再于55-65℃的条件下孵育15-25分钟使所述DNA聚合酶失活。优选地，所述DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶，所述聚合酶的浓度为1-5U/μL，所述聚合缓冲液是10×phi29DNA反应缓冲液；滚环扩增引物、DNA聚合酶、聚合缓冲液、牛血清白蛋白、dNTP和双蒸水的加入体积比为1：(1-5)：(10-20)：1：1：(42-56)。优选地，所述步骤4)中，荧光探针与所述滚环扩增产物的体积比为1：(20-30)，所述荧光探针与所述滚环扩增产物混合孵育1-2小时。优选地，所述淬灭剂是浓度为80-120μg/ml的氧化石墨烯。优选地，所述淬灭包括，将荧光探针与滚环扩增产物杂交的产物冷却后，加入淬灭剂、结合缓冲液和双蒸水。优选地，所述结合缓冲液是10×GObindingbuffer，所述淬灭剂、结合缓冲液和双蒸水的加入体积比为(10-20)：10：(50-60)。本申请能产生的有益效果包括：1)本申请所提供的试剂盒，能够提供基于滚环扩增技术的基因缺失突变荧光检测中所涉及到的关键试剂。2)本申请本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因缺失突变的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：PNA捕获探针、DNA探针、锁式探针、DNA连接酶、DNA聚合酶、滚环扩增引物和荧光探针。

【技术特征摘要】
1.一种基因缺失突变的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：PNA捕获探针、DNA探针、锁式探针、DNA连接酶、DNA聚合酶、滚环扩增引物和荧光探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PNA捕获探针是与靶基因缺失突变位点附近靠近3’端的10至25个碱基序列完全互补的PNA序列，所述PNA序列的羧基端与靶基因5’端碱基互补，所述PNA序列的氨基端与靶基因3’端碱基互补。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针是与靶基因缺失突变位点两端部分序列完全互补的DNA序列；其中，所述DNA探针与靶基因杂交时，与靶基因缺失突变位点处对应的部分是以单链形式存在的单链区；优选地，所述锁式探针的5’端和3’端与所述DNA探针的单链区完全互补，所述锁式探针的5’端和3’端的与所述DNA探针单链区的连接点位于所述DNA探针单链区的中心；优选地，所述DNA聚合酶和所述滚环扩增引物能够对由所述锁式探针形成的环状DNA进行滚环扩增；优选地，所述荧光探针是带有荧光标记的DNA信号探针，所述荧光探针能够与所述环状DNA滚环扩增产物的重复片段序列结合。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA连接酶选自E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶中的至少一种；所述DNA聚合酶选自phi29DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I中的至少一种；所述滚环扩增引物选自与环状DNA互补配对碱基序列中的至少15个以上碱基。5.使用权利要求1-4中任意一项所述的试剂盒进行基因缺失突变荧光检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)将所述PNA捕获探针固定在孔板底部，后在缓冲液条件下与靶基因杂交；2)使被固定在孔板底部的靶基因与DNA探针杂交；3)使与靶基因杂交后的DNA探针上的单链部分与锁式探针杂交，并使用连接酶进行环化，在滚环扩增引物和DNA聚合酶的作用下进行滚环扩增；4)使荧光探针与滚环扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐小军，赵超，邢淑，付盼，徐梦佳，徐皖星，
申请(专利权)人：中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所，中国科学院宁波材料技术与工程研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33