一种测定青芥辣中山葵含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定青芥辣中山葵含量的方法，属于分子生物学技术领域。利用液氮研磨使得山葵细胞充分破壁，利用植物基因组提取试剂盒提高基因组浓度、纯度，这两种方法结合有利于最大限度减小破壁不充分、基因组浓度低对山葵基因组得率的影响，从而影响到山葵含量测定准确性。本发明专利技术提取到的山葵基因组得率为传统方法的1.45～3倍，测量的准确度更高，测量误差小于10％。且从操作上来说，本方法简单容易实行，所需试剂都比较普通，能够节省实验室经济成本。

【技术实现步骤摘要】
一种测定青芥辣中山葵含量的方法
本专利技术涉及一种测定青芥辣中山葵含量的方法，属于分子生物学

技术介绍
青芥辣，原产日本，是以山葵(wasabi)、辣根等为主要原料，经磨碎、调配等工艺制成的固态复合调味料，色泽鲜绿，具有强烈的香辛味。它具有去腥，杀菌消毒、促进消化、增进食欲等作用。其中山葵不但口感好、营养丰富、而且还有免疫调节、抗菌、抗癌、抗氧化等多种药理作用，但由于山葵生长条件特殊、适宜生长种植的地方有限，现在国际市场上的山葵稀缺且价格昂贵。山葵含量是衡量青芥辣产品质量的重要指标，是青芥辣产品分析的重要内容。目前测量方法很少，成本高，效率低，准确性低。因此，建立一种经济而又准确实用的测定山葵含量的方法显得尤为必要。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种测定青芥辣中山葵含量的方法，以解决山葵测定过程中成本高，效率低，准确性低的问题。本专利技术通过下述技术方案实现，具体步骤包括：(1)将青芥辣样品加入无菌研钵中，倒入液氮充分研磨，直至样品成粉末，备用；(2)提取步骤(1)所得样品粉末的基因组；(3)根据山葵的myr基因和辣根的trnL基因序列，设计用于荧光定量PCR的特异性引物，其中，所述山葵的myr基因序列的PCR特异性引物为：正向引物：ACGCCCAGCCAACTAAAACAATA反向引物：CACCCGTCTCCTTGATGACCTTA所述辣根的trnL基因序列的PCR特异性引物为：正向引物：GGTAGTGAACTCCATTTG反向引物：ACGGACTTAATTAGATTGAG；(4)将步骤(2)得到的山葵和辣根基因组稀释成不同浓度，通过荧光定量法测定不同浓度时对应的山葵和辣根基因的阈值循环数(Ct)；(5)通过荧光定量法测定样品中山葵和辣根阈值循环数(Ct)，以辣根基因为参比基因，选择步骤4中任一山葵基因组浓度的样品作为标准样品，根据相对定量的方法计算出青芥辣样品中山葵的含量。进一步的，所述步骤(1)中的无菌研钵需预先冷冻。进一步的，所述步骤(2)利用植物基因组提取试剂盒提取基因。进一步的，所述山葵的myr基因如SEQIDNO.1所示。进一步的，所述荧光定量PCR反应体系为：SYBR酶(2×)：12.5μL上游引物：0.5μL下游引物：0.5μL双蒸水：1.5μL模板：10μL进一步的，所述荧光定量PCR反应程序为：进一步的，所述步骤(5)中的标准样品的山葵浓度为10％。本专利技术有益效果是：按照本专利技术的基因提取方法，提取到的山葵基因组得率为传统方法的1.45～3倍，本专利技术测定的山葵含量的准确度更高，误差在10％以内，远小于传统法测量的误差(40％-58％)，测量值相比传统法更接近于实际含量；且从操作上来说，本方法简单容易实行，所用试剂都比较普通廉价，大大降低了检测成本。具体实施方式本专利所用青芥辣、山葵、辣根均由珠海一统实业有限公司提供。已知含量的待测样品的配置：样品1：山葵含量5％，辣根含量95％；样品2：山葵含量10％，辣根含量90％；样品3：山葵含量15％，辣根含量85％。实施例1测定青芥辣中山葵含量的方法，具体步骤如下所示：(1)称取1g青芥辣样品加入预先冷冻的无菌研钵中，倒入液氮充分研磨，待液氮挥发继续加入液氮，如此反复直至样品呈细腻的粉末，备用。(2)按植物基因组提取试剂盒说明书提取步骤1所得样品粉末的DNA，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。(3)根据山葵的myr基因(如SEQIDNO.1所示)和辣根的trnL基因序列，设计用于荧光定量PCR特异性引物见表1，实时定量PCR反应体系及程序反应体系：SYBR酶(2×)：12.5μL上游引物：0.5μL下游引物：0.5μL双蒸水：1.5μL模板：10μL反应程序：表1本专利技术中RT-PCR引物。(4)将山葵和辣根基因组DNA稀释成不同浓度，通过荧光定量法测定不同浓度样品中山葵和辣根基因的阈值循环的数(Ct)(如表2)。(5)青芥辣中山葵的含量计算：采用相对定量的方法计算样品中山葵的含量，以辣根基因为参比基因，以含已知山葵基因组含量的DNA混合物作为校准的标准。对所有样品进行了山葵和辣根信号之间的Ct检测，并计算了山葵所占的百分比。按以下公式计算样品中山葵的含量：注：10％——标准样品中山葵DNA占总DNA的含量；Wasabi——山葵；ΔCt未知样品——以未知样品为模板，分别用山葵、辣根的特异性引物扩增所得Ct之差；ΔCt标准样品——以标准样品为模板，分别用山葵、辣根的特异性引物扩增所得Ct之差。按照上述计算公式，计算表2中待测样品中山葵含量：以山葵浓度为10％、35％和55％的样品分别作为标准样品，根据公式计算出待测青芥辣样品中山葵的含量为1.48％、1.40％和1.47％。表2.不同浓度样品中山葵基因的阈值循环数(Ct)。利用本专利技术方法测定已知山葵含量的样品1-3，测定得到的山葵含量见表3，可知本专利技术测得的山葵含量的误差小于10％。表3不同测定方法对样品1-3中山葵含量的测定结果对比例1传统法传统测定青芥辣中山葵含量的方法，具体步骤如下所示：1、称取1g山葵样品，加入2870微升提取液(10mMTris–HCl,pH8.0,150mMNaCl,2mMEDTA,1％SDS)，330微升盐酸胍溶液(5mol/L)，130微升蛋白酶K(20mg/mL)。2、将步骤1得到的混合物放到60℃加热3小时。3、12000rpm离心10分钟。4、转移上清到新的离心管，加入30微升RNase(10mg/mL)，60℃加热10分钟5、过树脂柱，加入50-200微升ddH20，离心，收集DNA溶液。6、根据山葵的myr基因和辣根的trnL基因序列，用于荧光定量的山葵PCR特异性引物(文献报道)，见表4。表4.传统方法中的RT-PCR引物7、实时定量PCR反应8、青芥辣中山葵的含量计算：采用相对定量的方法计算样品中山葵的含量，以辣根基因为参比基因，以10％山葵的含量样品为校准的标准。对所有样品进行了山葵和辣根信号之间的Ct检测，并计算了其山葵所占的百分比。按以下公式计算样品中山葵的含量：按照上述计算公式，计算待测样品1-3中山葵含量，测定结果见表3，可知，传统法测定得到的山葵含量与已知含量差别较大，准确度不高，误差在40-58％之间。实施例1及对比例1提取的基因组质量鉴定：通过测定两种提取方法所得基因组的浓度、纯度和得率，发现液氮研磨结合植物宏基因组提取试剂盒提取到的基因组DNA浓度在7.5-128.8ng/μL之间，盐酸胍结合凝胶柱提取到的基因组DNA浓度在3.6-48.2ng/μL之间，相同的样品利用液氮研磨结合植物宏基因组提取试剂盒所提基因组的纯度更高，且利用植物宏基因组提取试剂盒提取所得的DNA得率约为盐酸胍结合凝胶柱法提取的1.45～3倍(液氮研磨结合植物提取试剂盒的提取结果见表5，盐酸胍结合凝胶柱的提取结果见表6)。因此，本专利技术的测量方法比传统法测量更加准确。表5.液氮研磨结合植物提取试剂盒的提取结果。表6.盐酸胍结合凝胶柱的提取结果。对比例2：采用文献报道的PCR特异性引物与实施例1中的方法一致，其中将本专利技术自行设计的山葵PCR特异性引物用文献中报道的PCR引物(见表4)替换，测量样品1-3中的山葵含量，测量结果见表3。可知，本专利技术设计本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定青芥辣中山葵含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将青芥辣样品加入无菌研钵中，倒入液氮充分研磨，直至样品成粉末，备用；(2)提取步骤(1)所得样品粉末的基因组；(3)根据山葵的myr基因和辣根的trnL基因序列，设计用于荧光定量PCR的特异性引物；(4)将山葵和辣根基因组稀释成不同浓度，通过荧光定量法测定不同浓度山葵和辣根基因的阈值循环数(Ct)；(5)通过荧光定量法测定样品中山葵和辣根阈值循环数(Ct)，以辣根基因为参比基因，选择步骤4中任一山葵基因组浓度的样品作为标准样品，根据相对定量的方法计算出青芥辣样品中山葵的含量；其中，所述山葵的myr基因序列的PCR特异性引物为：正向引物：ACGCCCAGCCAACTAAAACAATA反向引物：CACCCGTCTCCTTGATGACCTTA辣根的trnL基因序列的PCR特异性引物为：正向引物：GGTAGTGAACTCCATTTG反向引物：ACGGACTTAATTAGATTGAG。

【技术特征摘要】
1.一种测定青芥辣中山葵含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将青芥辣样品加入无菌研钵中，倒入液氮充分研磨，直至样品成粉末，备用；(2)提取步骤(1)所得样品粉末的基因组；(3)根据山葵的myr基因和辣根的trnL基因序列，设计用于荧光定量PCR的特异性引物；(4)将山葵和辣根基因组稀释成不同浓度，通过荧光定量法测定不同浓度山葵和辣根基因的阈值循环数(Ct)；(5)通过荧光定量法测定样品中山葵和辣根阈值循环数(Ct)，以辣根基因为参比基因，选择步骤4中任一山葵基因组浓度的样品作为标准样品，根据相对定量的方法计算出青芥辣样品中山葵的含量；其中，所述山葵的myr基因序列的PCR特异性引物为：正向引物：ACGCCCAGCCAACTAAAACAATA反向引物：CACCCGTCTCCTTGATGACCTTA辣根的trnL基因序列的PCR特异性引物为：正向引物：GGTAGTGAACTCCATTTG反向引物：ACGGACTTAATTAGATTGAG。2.根据权利要求1所述的一种测定青芥辣中山葵含...

【专利技术属性】
技术研发人员：方芳，王志海，李兆雯，徐洁，吴新，
申请(专利权)人：珠海天禾食品有限公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44