一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，公开了一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法。通过杂交链式反应对目标核酸序列进行信号放大，得到HCR反应产物；将水溶性聚集诱导发光分子与不同浓度的HCR反应产物进行混合，通过测量荧光强度绘制核酸浓度的标准曲线，实现核酸定量分析；将巯基DNA修饰的金纳米粒子加入到吸附有聚集诱导发光分子的HCR反应产物中，观察溶液的颜色变化，实现核酸定性分析；所述的水溶性聚集诱导发光分子具有如下式(I)所示的结构通式。本发明专利技术的检测方法结合了聚集诱导发光效应和表面等离子体色度分析法，具有简便、实时、免纯化处理等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法。
技术介绍
随着近代分子诊断方法的发展，核酸分子检测/分析在肿瘤诊断，病原微生物鉴定及遗传性疾病筛查领域获得了越来越多的关注。最近发展起来的非侵入式的液体活检方法表明，血液中的核酸片段可以提供胎儿的基因、肿瘤的复发情况及感染疾病的种类信息。然而，传统的核酸检测方法，如聚合酶链式反应(PCR)方法，电化学分析及Southern/Northern印迹杂交方法具有成本高、操作复杂、响应速度慢等问题。发展新颖的、易操作、响应灵敏的核酸检测分析方法具有重要的意义。即时检测方法(Point-of-caretesting，POCT)是一种便携、原位实时分析的检测方法。目前为止，许多精巧的POCT方法被设计出来，通常，构建POCT是基于以下的材料，包括：金属纳米离子、碳纳米管、磁性纳米粒子、氧化石墨烯、量子点及有机发光团等。比如：基于金纳米粒子的色度分析法具有很高的检测灵敏度，同时产生的信号可以直接通过肉眼进行观测。但是，这种基于溶液色度改变的检测方法并不支持定量的分析。相比之下，有机发光团由于其可调控的发光及化学性质，被广泛应用于定量化荧光分析中。将两种检测方法结合起来就可以实现通过一次测试便获得两套互补的信号。然而，对于传统的荧光分子而言，往往需要对生物分子进行化学修饰及纯化分离。这大大增加了操作难度及成本。因此，发展一种无标记、免洗的荧光分子具有重要的意义。聚集诱导发光(aggregation-inducedemission，AIE)是一类反常的光物理现象。具体表现为具有螺旋状的荧光分子在分子状态下发出微弱的荧光。而当分发生聚集或运动受到限制时可以发出强烈的荧光。基于AIE分子的在游离状态下的低背景信号，一系列点亮型的生物探针被开发出来。基于此，AIE分子在荧光分析检测中具有重要的应用前景。
技术实现思路
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本专利技术的首要目的在于提供一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法。本专利技术的另一目的在于提供上述核酸检测方法在离体血液中循环肿瘤核酸或病原微生物基因片段的即时检测中的应用。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法，包括如下步骤：(1)通过杂交链式反应(hybridizationchainreaction，HCR)对目标核酸序列进行信号放大，超滤除去未反应的短片段核酸，得到HCR反应产物；(2)将水溶性聚集诱导发光分子与不同浓度的步骤(1)的HCR反应产物进行混合，得到吸附有聚集诱导发光分子的HCR反应产物，通过测量荧光强度绘制核酸浓度的标准曲线，实现核酸定量分析；(3)将巯基DNA修饰的金纳米粒子加入到步骤(2)中吸附有聚集诱导发光分子的HCR反应产物中，观察溶液的颜色变化，实现核酸定性分析；所述的水溶性聚集诱导发光分子具有如下式(I)所示的结构通式：其中，R1～R4为独立的C1-18的烷基或烷氧基；R5～R16为独立的氢或C1-18的烷基；X为卤素基团。优选地，所述的烷基为甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基或叔丁基。(式(I)结构通式化合物参考文献制备，Chem.Eur.J.2010,16,1232–1245)。进一步地，所述的目标核酸序列为DNA或RNA序列。优选地，所述的水溶性聚集诱导发光分子具有如下式(II)所示的结构式：优选地，步骤(1)中所述超滤是指用尺寸为3～100kDa的超滤管进行超滤，超滤次数为1～5次，每次超滤结束后，通过超声处理20s～10min，使粘附在管壁上的核酸充分脱落。优选地，步骤(3)中所述巯基DNA修饰的金纳米粒子的尺寸为5～100nm，表面修饰的DNA数目为10～10000条，每条DNA的碱基个数为5～100个。优选地，步骤(3)中所述巯基DNA修饰的金纳米粒子加入的浓度以金纳米粒子计算为1～50nM。上述核酸检测方法在离体血液中循环肿瘤核酸或病原微生物基因片段的即时检测中的应用。相对于现有技术，本专利技术的检测方法具有如下优点及有益效果：本专利技术的检测方法结合了聚集诱导发光效应和表面等离子体色度分析法，具有简便、实时、免化学标记、免纯化处理、背景信号低、成本低，可以产生双模式信号的优势。附图说明图1为本专利技术实施例1步骤(2)得到的不同浓度HCR产物的凝胶电泳结果图(a)和HCR产物的原子力显微镜表征图(b)。图2为本专利技术实施例1步骤(3)中将HCR产物与TA-TPE相互作用后的研究结果图：a、TA-TPE与HCR产物作用前后的荧光强度变化的比较图；b、TA-TPE与不同DNA结构作用之后荧光强度的变化图；c、不同浓度的TA-TPE与HCR产物作用的荧光强度分析结果图。图3为本专利技术实施例1中将TA-TPE与不同浓度目标DNA(目标DNA浓度分别为0、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM)的HCR产物相互作用后的荧光光谱图(a)及根据荧光强度与核酸浓度所绘制的标准曲线(b)。图4为本专利技术实施例1中将TA-TPE与步骤(4)中各个不同DNA链序列相互作用后的荧光检测结果图。图5为本专利技术实施例2中不同摩尔比的巯基DNA修饰的金纳米粒子溶液与不同浓度的TA-TPE混合后的溶液颜色变化图。图6为本专利技术实施例2中两组颜色差距较大的纳米金溶液(TA-TPE浓度分别为5μmol和1μmol，金纳米粒子与DNA的摩尔浓度比为1:100(适中)的透射电镜表征结果图。图7为本专利技术实施例2中选择适中浓度的巯基DNA修饰的金纳米粒子与不同浓度TA-TPE作用后，加入到不同浓度的目标DNA的HCR产物中所得溶液颜色的变化和溶液的吸收光谱图。图8为本专利技术实施例3中将TA-TPE与不同浓度目标RNA(目标RNA浓度分别为0、10nM、20nM、40nM、60nM、80nM、100nM)的HCR产物相互作用后的荧光光谱图(a)和根据荧光强度与microRNA浓度得到的标准曲线(b)。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1(1)H1和H2DNA首先溶解于1×PBS缓冲液中，然后分别加热至95℃，恒温5min，然后降低至室温并保持1h。接着将H1和H2混合备用。H1和H2DNA的序列分别为：DNA-H1：ttaacccacgccgaatcctagactcaaagtagtctaggattcggcgtg(SEQIDNo.1)；DNA-H2：agtctaggattcggcgtgggttaacacgccgaatcctagactactttg(SEQIDNo.2)。(2)不同浓度的目标DNA(0.0625μM、0.125μM、0.25μM、0.5μM和1μM)与H1和H2进行混合，室温反应2h，得到HCR反应产物。通过超滤处理HCR产物以降低背景信号。具体步骤为：HCR产物首先通过1×PBS进行稀释，稀释倍数为4，然后将稀释液加入到100kDa(购买自Millipore)的超滤管中。样品经过离心处理(10000r/min，2min)，然后超声处理30s。重复这一步骤2遍。然后通过凝胶电本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：(1)通过杂交链式反应对目标核酸序列进行信号放大，超滤除去未反应的短片段核酸，得到HCR反应产物；(2)将水溶性聚集诱导发光分子与不同浓度的步骤(1)的HCR反应产物进行混合，得到吸附有聚集诱导发光分子的HCR反应产物，通过测量荧光强度绘制核酸浓度的标准曲线，实现核酸定量分析；(3)将巯基DNA修饰的金纳米粒子加入到步骤(2)中吸附有聚集诱导发光分子的HCR反应产物中，观察溶液的颜色变化，实现核酸定性分析；所述的水溶性聚集诱导发光分子具有如下式(I)所示的结构通式：

【技术特征摘要】
1.一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法，其特征在于包括如下步骤：(1)通过杂交链式反应对目标核酸序列进行信号放大，超滤除去未反应的短片段核酸，得到HCR反应产物；(2)将水溶性聚集诱导发光分子与不同浓度的步骤(1)的HCR反应产物进行混合，得到吸附有聚集诱导发光分子的HCR反应产物，通过测量荧光强度绘制核酸浓度的标准曲线，实现核酸定量分析；(3)将巯基DNA修饰的金纳米粒子加入到步骤(2)中吸附有聚集诱导发光分子的HCR反应产物中，观察溶液的颜色变化，实现核酸定性分析；所述的水溶性聚集诱导发光分子具有如下式(I)所示的结构通式：其中，R1～R4为独立的C1-18的烷基或烷氧基；R5～R16为独立的氢或C1-18的烷基；X为卤素基团。2.根据权利要求1所述的一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析双模式核酸检测方法，其特征在于：所述的烷基为甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基或叔丁基。3.根据权利要求1所述的一种聚集诱导发光/表面等离子体色度分析...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐本忠，沈建磊，秦安军，张忆茹，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44