通用隔断超快扩增镁、钠切割型功能核酸可视化检测方法技术

本发明专利技术提供一种通用隔断超快扩增的镁、钠切割型功能核酸可视化检测方法。本发明专利技术通过巧妙地设计引物、模板及探针，使得在镁、钠离子存在下可对模板进行超快扩增，并使扩增产物在适宜环境中形成G四链体。进一步利用G四链体的类过氧化物酶活性进行显色，解决了传统PCR产物难于可视化检测的难题，实现了对镁、钠离子的快速、可视化检测。不仅如此，本发明专利技术提供的方法对镁、钠离子具有高特异、高灵敏的特点，检测结果更加客观、准确。

【技术实现步骤摘要】
通用隔断超快扩增镁、钠切割型功能核酸可视化检测方法
本专利技术涉及生物传感器
，具体地说，涉及一种通用隔断超快扩增的镁、钠切割型功能核酸可视化检测方法。
技术介绍
钠是一种金属元素，化学符号是Na，原子序数是11，原子量是22.9898，属第IA族，是碱金属元素的代表，质地柔软，能与水反应生成氢氧化钠，放出氢气，化学性质较活泼。钠元素以盐的形式广泛的分布于陆地和海洋中，钠也是人体肌肉组织和神经组织中的重要成分之一。人体中钠的摄取主要是通过食物食盐摄取，缺了它就会饮食无味，还觉得软弱无力；但若长期摄入过多，则很容易影响健康，诱发疾病，例如使尿液中的蛋白质含量升高，引起肾上腺和脑组织释放一种使细胞兴奋性增加的因子，导致动脉收缩，血压升高。血压升高是导致心血管疾病的主要原因，大约62％的中风和49％的冠状动脉心脏病的主要病因是高血压。目前，国内外检测钠离子含量的方法很多，如离子色谱法、火焰原子发射光谱法、火焰原子收法、流动注射技术和离子选择性电极相结合的方法等。应用这些方法测定钠离子含量的研究成果也有相应的报导，但操作繁琐、耗时长，而且需要专业的人员进行操作。因此，研究出简单快速、成本低廉、可准确定量的检测方法十分必要。镁，化学符号是Mg，原子序数是12，原子量是24，属第IIA族，是一种银白色有金属光泽的金属，在自然界中分布较广。中国营养学会建议，成年男性每天约需镁350毫克，成年女性约为300毫克，孕妇以及喂奶期女性约为450毫克，2-3岁儿童为150毫克，3-6岁为200毫克。可耐受最高摄入量(UL)定为700mg/d。镁是人体细胞内的主要阳离子，浓集于线粒体中，仅次于钾和磷，在细胞外液仅次于钠和钙居第三位，是体内多种细胞基本生化反应的必需物质。镁是一种参与生物体正常生命活动及新陈代谢过程必不可少的元素。镁缺乏在临床上主要表现为情绪不安、易激动、手足抽搐、反射亢进等，正常情况下，由于肾的调节作用，口服过量的镁一般不会发生镁中毒。当肾功能不全时，大量口服镁可引起镁中毒，表现为腹痛、腹泻、呕吐、烦渴、疲乏无力，严重者出现呼吸困难、紫绀、瞳孔散大等。常见的镁离子的检测方法主要有原子光谱法，包括原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱法和焚光光谱法，可见分光光度法，流动注射化学发光法和微分电位溶出法等，但是这些检测方法都需要昂贵的仪器和经过专业培训的操作人员，样品前处理也比较繁琐，不具有普遍适用性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种切割型快速检测镁、钠离子的系统。本专利技术的另一目的是提供一种通用隔断超快扩增的镁、钠切割型功能核酸可视化检测方法。为了实现本专利技术目的，专利技术人根据镁离子和钠离子的特异性核酶，设计通用隔断引物对其进行超快聚合酶链式反应(superPolymeraseChainReaction,sPCR)，结合富G序列在K+存在条件下形成具有类过氧化物酶活性的G四链体，构建了一种新型的基于隔断引物的镁离子、钠离子切割型功能核酸比色传感器。第一方面，本专利技术提供一种快速检测镁、钠离子的系统，包括：(1)切割体系，(2)sPCR扩增体系，(3)HCR体系，(4)包含ABTS显色液的检测体系。所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、sPCR扩增体系和HCR体系进行反应后所得产物进行显色检测；其中，所述切割体系包括底物链I和酶链I以及底物链II和酶链II：底物链I：5′-CTCTATCTATrA-GGAAGTACCGCCGC-3′酶链I：5′-GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG-3′其中，rA表示核糖核酸；-表示钠离子切割位点；底物链II：5′-GTCACGAGTCACTATrA-GGAAGATGGCGAAA-3′酶链II：5′-TTTCGCCATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGACTCGTGAC-3′其中，rA表示核糖核酸；-表示镁离子切割位点；所述sPCR扩增体系包括：正向隔断引物I、反向引物I、正向隔断引物II、反向引物II、模板：正向隔断引物I：5′-AGACGAAGCACTGGTTGAAACTCC-隔断物-GGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′反向引物I：5′-GGAAGTACCGCCGCGGAGGGA-3′正向隔断引物II：5′-AGTCTAGGATTCGGCGTCCCTTAA-隔断物-TTAAGGGACGCCGAATCCTAGACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′反向引物II：5′-GGAAGATGGCGAAATTCGGGGC-3′模板：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTAGCCCCGAATTTCGCCATCTTCCTCCCTCCGCGGCGGTACTTCC-3′；所述HCR体系包括4条探针：探针1：5′-AGGGCGGGTGGGTGGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTCCCCAGACGAAGCACTGGTTGATGGGT-3′探针2：5′-TGGGTAGACGAAGCACTGGTTGAAACTCCTCAACCAGTGCTTCGTCTGGGGTGGGTAGGGCGGG-3′探针3：5′-AGGGCGGGTGGGTTAAGGGACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTCGGGT-3′探针4：5′-GGGTAGTCTAGGATTCGGCGTCCCTTAAGACGCCGAATCCTAGACTACTTTGAGGGCGGGTGGG-3′。其中，所述正向隔断引物中的隔断物为聚六乙二醇。其它能够阻止PCR延伸的隔断结构也可用于本专利技术。所述DNA聚合酶为ExTaqDNA聚合酶，所述缓冲液为10×ExTaqBuffer，二者与所述dNTP均购自赛默飞科技(ThermoScientificLifeTechnologies)。本专利技术所述的检测体系包括：酶活缓冲液，氯高铁血红素溶液。其中，所述酶活缓冲液为：100mMTris、120mMNaCl、10mMMgCl2、100mMKCl，pH8.4。所述氯高铁血红素溶液为20mM的氯高铁血红素原液与上述酶活缓冲液按照2μL：1mL的比例混合后的氯高铁血红素稀释溶液。本专利技术还提供前述系统在检测镁、钠离子方面中的应用，所述检测可表现为定性检测或定量检测。第二方面，本专利技术提供了一种基于前述系统的通用隔断超快扩增镁、钠切割型功能核酸可视化定性检测方法，包括如下步骤：S1、向所述切割体系中加入待测样品，进行切割反应；S2、将S1所得切割产物加入所述sPCR扩增体系中进行超快聚合酶链式反应，得sPCR产物；S3、将所述sPCR产物加入所述HCR体系中进行HCR反应，得HCR产物；S4、利用所述检测体系对所述HCR产物进行检测。S1具体如下：将底物链与酶链按等摩尔比例混合，用缓冲液稀释至浓度1μM-2μM，85℃-95℃加热15min，然后降温至25-37℃，得到核酶液；向35μL所述核酶液中加入待测样品溶液，形成40μL体系，于36-38℃孵育4-6min，然后加入4-6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测镁、钠离子的系统，其特征在于，包括：(1)切割体系，(2)sPCR扩增体系，(3)HCR体系，(4)包含ABTS显色液的检测体系；所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、sPCR扩增体系和HCR体系进行反应后所得产物进行显色检测；其中，所述切割体系包括底物链I和酶链I以及底物链II和酶链II：底物链I：5′‑CTCTATCTATrA‑GGAAGTACCGCCGC‑3′酶链I：5′‑GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG‑3′其中，rA表示核糖核酸；‑表示钠离子切割位点；底物链II：5′‑GTCACGAGTCACTATrA‑GGAAGATGGCGAAA‑3′酶链II：5′‑TTTCGCCATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGACTCGTGAC‑3′其中，rA表示核糖核酸；‑表示镁离子切割位点；所述sPCR扩增体系包括：正向隔断引物I、反向引物I、正向隔断引物II、反向引物II、模板：正向隔断引物I：5′‑AGACGAAGCACTGGTTGAAACTCC‑隔断物‑GGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC‑3′反向引物I：5′‑GGAAGTACCGCCGCGGAGGGA‑3′正向隔断引物II：5′‑AGTCTAGGATTCGGCGTCCCTTAA‑隔断物‑TTAAGGGACGCCGAATCCTAGACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC‑3′反向引物II：5′‑GGAAGATGGCGAAATTCGGGGC‑3′模板：5′‑TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTAGCCCCGAATTTCGCCATCTTCCTCCCTCCGCGGCGGTACTTCC‑3′；所述HCR体系包括4条探针：探针1：5′‑AGGGCGGGTGGGTGGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTCCCCAGACGAAGCACTGGTTGATGGGT‑3′探针2：5′‑TGGGTAGACGAAGCACTGGTTGAAACTCCTCAACCAGTGCTTCGTCTGGGGTGGGTAGGGCGGG‑3′探针3：5′‑AGGGCGGGTGGGTTAAGGGACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTCGGGT‑3′探针4：5′‑GGGTAGTCTAGGATTCGGCGTCCCTTAAGACGCCGAATCCTAGACTACTTTGAGGGCGGGTGGG‑3′。...

【技术特征摘要】
1.一种快速检测镁、钠离子的系统，其特征在于，包括：(1)切割体系，(2)sPCR扩增体系，(3)HCR体系，(4)包含ABTS显色液的检测体系；所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、sPCR扩增体系和HCR体系进行反应后所得产物进行显色检测；其中，所述切割体系包括底物链I和酶链I以及底物链II和酶链II：底物链I：5′-CTCTATCTATrA-GGAAGTACCGCCGC-3′酶链I：5′-GCGGCGGTACCAGGTCAAAGGTGGGTGAGGGGACGCCAAGAGTCCCCGCGGTTAGATAGAG-3′其中，rA表示核糖核酸；-表示钠离子切割位点；底物链II：5′-GTCACGAGTCACTATrA-GGAAGATGGCGAAA-3′酶链II：5′-TTTCGCCATCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGACTCGTGAC-3′其中，rA表示核糖核酸；-表示镁离子切割位点；所述sPCR扩增体系包括：正向隔断引物I、反向引物I、正向隔断引物II、反向引物II、模板：正向隔断引物I：5′-AGACGAAGCACTGGTTGAAACTCC-隔断物-GGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′反向引物I：5′-GGAAGTACCGCCGCGGAGGGA-3′正向隔断引物II：5′-AGTCTAGGATTCGGCGTCCCTTAA-隔断物-TTAAGGGACGCCGAATCCTAGACTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′反向引物II：5′-GGAAGATGGCGAAATTCGGGGC-3′模板：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCTCAGTATCAGTGCTATACGTCGATCAGTAGCCCCGAATTTCGCCATCTTCCTCCCTCCGCGGCGGTACTTCC-3′；所述HCR体系包括4条探针：探针1：5′-AGGGCGGGTGGGTGGAGTTTCAACCAGTGCTTCGTCTCCCCAGACGAAGCACTGGTTGATGGGT-3′探针2：5′-TGGGTAGACGAAGCACTGGTTGAAACTCCTCAACCAGTGCTTCGTCTGGGGTGGGTAGGGCGGG-3′探针3：5′-AGGGCGGGTGGGTTAAGGGACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，罗云波，黄昆仑，杜再慧，田晶晶，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11