一种快速检测镰刀菌DNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测镰刀菌DNA的方法，其包括以下步骤：S1：提供特异性识别镰刀菌DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为一条包含G‑四链体互补序列的核苷酸序列；S2：将所述DNA分子机器与待测样品相互混合；S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA扩增反应；S4：引入硫黄素T，诱导产生G‑四链体结构，并与G‑四链体结合，产生荧光；检测和记录该荧光。本发明专利技术可将疑似含有镰刀菌DNA的小麦待测样品中的核酸信号转化为G‑四链体，在常温恒温下即可实现G‑四链体的不断扩增，将核酸的信号高度放大，通过硫黄素T结合G‑四链体产生稳定的荧光信号，从而实现高灵敏度的核酸快速定性分析测定。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测镰刀菌DNA的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速检测镰刀菌DNA的方法。
技术介绍
镰刀菌是一类世界性分布的真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重要病害之一。目前，对于镰刀菌的检测的等温可视为检测，大多利用环介导等温扩增测定或者通过PCR法测定。尽管恒温扩增技术以其恒温优势以及扩增效率高的特点得到广泛重视，但恒温扩增产物的检测未能突破荧光染料嵌入进行实时分析或凝胶电泳进行终点分析等传统的核酸扩增检测方法，真正意义上实现快速、简单、便携地检测核酸。传统的荧光标记核酸扩增检测技术，需要进行荧光探针标记，操作繁琐，费时又昂贵并且其灵敏度不高。依托传统技术构建的荧光传感器虽然背景信号低，稳定性强，然而，由于实际样本成分复杂，靶标DNA含量极低，这就要求检测方法具有极高的灵敏度和特异性，常规的荧光标记核酸扩增检测技术的灵敏度和选择性无法满足其检测需求。G-四链体(G-quadruplex)是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。G-四链体(G-quartet)是四链体的结构单元，由Hoogsteen氢键连接4个G形成环状平面，两层或以上的四链体通过π-π堆积形成四链体。硫黄素T(ThioflavinT，ThT)是一种水溶性荧光染料，自身荧光信号很低，但在单链、双链或三链DNA/RNA与G-四链体同时存在时，硫黄素T(ThioflavinT，ThT)能够区分不同的核酸类型，对G-四链体具有很强的结构选择性，与G-四链体结合并产生更加稳定的荧光。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供一种G-四链体分子机器及核酸检测方法。G-四链体生成机器识别靶序列，并在靶序列的牵引之下扩大生成G-四链体，与硫磺素结合产生稳定的荧光，从而将靶序列信号扩大，达到定性的效果。无需荧光探针标记，灵敏度更高，操作更简单。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：一种快速检测镰刀菌DNA的方法，其包括以下步骤：S1：提供特异性识别镰刀菌DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为包括G-四链体互补序列的核苷酸序列；S2：将所述DNA分子机器与待测样品相互识别；S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA扩增反应；S4：引入硫黄素T，诱导产生G-四链体结构，并与G-四链体结合，产生荧光；S5：记录荧光发光情况。作为本专利技术一个优选的实施方法中，所述的DNA分子机器从5’端到3’端依次是G-四链体合成模板、切口酶识别区、稳定区和靶序列识别区。作为本专利技术一个优选的实施方法中，所述靶序列识别区与镰刀菌DNA序列3’末端互补；所述的切口酶识别区为切口酶能够识别序列的互补序列；所述的G-四链体合成模板位于核苷酸序列的5’末端，G-四链体合成模板为G-四链体序列的互补序列。作为本专利技术一个优选的实施方法中，上述S3和S4中，还需加入Mg2+、dNTP和缓冲液，并置于恒温条件下扩增。作为本专利技术一个优选的实施方法中，所述恒温的温度为45-65℃，扩增时间为15-30min。作为本专利技术一个优选的实施方法中，上述S5中，每隔30s读取一次荧光并记录，所述记录方式为，对比溶液的颜色深浅的书面描述、拍照、录像或者测定吸收光谱。作为本专利技术一个优选的实施方法中，上述S2中的待测样品的浓度为2～8μM，所述DNA分子机器的浓度为1～120nM，将待测样品与DNA分子机器混合均匀，得到混合溶液。步骤S3中将所述缓冲液10～40μL、聚合酶6～10μL、切口酶6～10μL和dTP3～10μL加入S2中的混合溶液中参与反应，得到反应液；步骤S4中将所述硫黄素T6～10μL、金属阳离子6～36μL加入到反应液中产生荧光反应。作为本专利技术一个优选的实施方法中，所述dNTP浓度为0.12～0.50mM；所述聚合酶浓度为0.112～0.236U/uL；所述切口酶的浓度为0.01～0.06U/uL；所述硫黄素T的的浓度为0.1～70uM；所述缓冲液包括浓度为30～70mM，PH8.3～9.0的Tris·HCL、浓度为0.1％～0.6％的tween20、浓度为130～160mM的KCl、浓度为10～60mM的(NH4)2SO4和浓度为30～70mM的NaCL。所述金属离子的浓度为1～9mM。作为本专利技术一个优选的实施方法中，所述待测样品的前处理步骤包括：剪取100mg植物待测病叶叶片，将待测病叶病叶的叶片置于液研钵中研磨得到组织材料，将所述组织材料固液分离得到植物组织材料，即所需的待测样品。本专利技术方法中，所述靶序列识别区的序列包括：5’-GTCTTGTCTTCC-3'。本专利技术方法中，所述切口酶识别区域序列为5’-…GACTC…-3’；所述切口酶来源于重组大肠杆菌菌株；G-四链体合成模板为5’-…CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCC…-3’。(三)有益效果本专利技术的有益效果是：1.本专利技术可将疑似含有镰刀菌DNA的小麦待测样品中的核酸信号转化为G-四链体，在常温恒温下即可实现G-四链体的不断扩增，将核酸的信号高度放大，通过硫黄素T结合G-四链体产生稳定的荧光信号，从而实现高灵敏度的核酸快速定性分析测定。2.相对于
技术介绍
中所公开的专利技术，本专利技术所提供的DNA分子机器，序列简单，在聚合酶和切口酶的作用下，就可实现待测核酸信号的转化和扩增，步骤简单，灵敏性更强。3.本专利技术可构建一种新型传感器构建出灵敏度高且不需要有荧光探针标记的新型传感器，用于快速检测镰刀菌DNA。4.本专利技术荧光信号可在简易手持设备(如手持紫外灯管/电筒)的帮助下肉眼观察确定，适用于多种快速核酸测定的场合。特异性强，在恒温、单个管中即可进行，无需使用价格昂贵或体积庞大的精密温控设备，便于进行现场的快速检测和分析。5.本专利技术G-四链体分子机器，用于将样品中的核酸信号转化为G-四链体，在等温或常温下即可实现G-四链体的不断扩增，将核酸的信号高度放大，通过硫磺素T结合G-四链体产生稳定的荧光信号，从而实现高灵敏度的核酸快速定性分析测定，相对于现有技术的恒温扩增技术，减少荧光探针标记的处理步骤，在样品的定性检测上灵敏度更高，使用更方便，成本更低。附图说明图1为线形DNA分子机器结构示意图；图2为环形DNA分子机器结构示意图；图3为实施例1不同DNA分子机器的荧光强度测定曲线图；图4为实施例2中不同浓度的硫黄素T的荧光强度测定曲线图；图5为实施例3中不同放置时间的荧光强度测定曲线图；图6为实施例4中不同浓度的DNA分子机器和待测序列浓度的荧光强度测定曲线图。具体实施方式为了更好的解释本专利技术，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本专利技术作详细描述。一种快速检测镰刀菌DNA的方法，其包括以下步骤：S1：提供特异性识别镰刀菌DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为包括G-四链体互补序列的核苷酸序列；S2：将所述DNA分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测镰刀菌DNA的方法，特征在于，其包括以下步骤：S1：提供特异性识别镰刀菌DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为一条包含G‑四链体互补序列的核苷酸序列；S2：将所述DNA分子机器与待测样品相混合；S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA新链合成、形成单链切口、不断剥离产生富G序列片段的系列反应；S4：引入硫黄素T，诱导富G序列片段产生G‑四链体结构，并与G‑四链体结合，产生荧光；S5：记录荧光发光情况。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测镰刀菌DNA的方法，特征在于，其包括以下步骤：S1：提供特异性识别镰刀菌DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为一条包含G-四链体互补序列的核苷酸序列；S2：将所述DNA分子机器与待测样品相混合；S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA新链合成、形成单链切口、不断剥离产生富G序列片段的系列反应；S4：引入硫黄素T，诱导富G序列片段产生G-四链体结构，并与G-四链体结合，产生荧光；S5：记录荧光发光情况。2.如权利要求1所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于：所述的DNA分子机器从5’端到3’端依次是G-四链体合成模板、切口酶识别区、稳定区和靶序列识别区。3.如权利要求2所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于：所述靶序列识别区与镰刀菌DNA序列3’末端互补；所述的切口酶识别区为切口酶能够识别序列的互补序列；所述的G-四链体合成模板位于核苷酸序列的5’末端，且G-四链体合成模板为G-四链体序列的互补序列。4.如权利要求3所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于，所述靶序列识别区的序列包括：5’-GTCTTGTCTTCC-3'。5.如权利要求3所述的快速检测镰刀菌DNA的方法，其特征在于：所述切口酶识别区的序列包括5’-…GACTC…-3’，所述切口酶来源于重组大肠杆菌菌株；所述G-四链体合成模板序列包括5’-…CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：高飞，张晓婷，周琳，许娟，杜鹏强，张艳丽，谢源，李洪连，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41