基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于食品安全检测分析技术领域，涉及一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括以下组份：(1)转录激活因子样效应物核酸酶；能够特异识别大肠杆菌O157:H7的16S rDNA；(2)“拟人”分子信标。利用该试剂盒或该检测方法，能够高灵敏的检测大肠杆菌O157:H7。

【技术实现步骤摘要】
基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于食品安全检测分析
，更具体地，涉及一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
食源性致病菌污染是影响我国食品安全的最主要因素之一。其中大肠杆菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)因其易发易感源头多而受到广泛关注。大肠杆菌O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属，革兰氏染色阴性，可产生大量的Vero毒素(VT)，也称作类志贺氏毒素(SLT)，是主要致病因子。它的感染剂量极低，通常是突然发生剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，严重者可导致死亡。据报道，世界上迄今已有上百次大肠杆菌O157:H7感染性腹泻的爆发流行，目前大肠杆菌O157:H7病例已波及到五大洲，呈现世界流行之势。目前，反复增菌实验以及菌落分离鉴别等实验是传统的食源性致病菌检测方法，耗时长，完成一次需要数天甚至十几天以上的时间，而且程序繁琐，也会因为样品细菌浓度过低给培养造成困难。除了传统方法以外，随着科学技术的进步，针对食源性致病菌检测的方法还包括免疫学方法和分子生物学实验法等比传统方法更灵敏、快捷的检测方法。基于免疫学基础建立的检测方法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)，该方法准确性高，但过程较为繁琐；基于分子生物学技术建立起来的方法主要包括聚合酶链式反应(PCR)技术、生物发光检测法以及环介导恒温扩增技术(LAMP)等，这些方法灵敏度高，具备准确、高效、自动化的特点，但需要对致病菌进行灭活处理，还要提取DNA，增加了过程的复杂度。随着人们对食品安全的愈发重视，如何更快更灵敏更便捷地检测食源性致病菌成为一个热门研究领域。因此，现在亟需一种快速灵敏便捷的现场检测方法来检测大肠杆菌O157:H7，以保障食品安全和人民健康。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒及检测方法。利用该试剂盒或该检测方法，能够高灵敏的检测大肠杆菌O157:H7。为了实现上述目的，本专利技术的第一方面提供一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒，该试剂盒包括以下组份：(1)转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)；能够特异识别大肠杆菌O157:H7的16SrDNA；具体地，TALENs能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的16SrDNA中18bp长的一段序列，该序列一条链具有如下碱基序列：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’(SEQIDNO：5)(2)“拟人”分子信标，由以下部分组成：发夹：5’-GATCAACTACTACTTGGTAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTTGTTTCTCTAATTAAGGC-3’(SEQIDNO：1)；其中，5’端第18位T碱基上和3’端第18位T碱基上分别连接有荧光基团和与其相应的猝灭基团；左臂：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAATCCAAGTAGTAGTTGATC-3’(SEQIDNO：2)；右臂：5’-GCCTTAATTAGAGAAACTTTACTCACCCGTCCGCCA-3’(SEQIDNO：3)；左腿：5’-TTACTCACCCGTCCGCCA-3’(SEQIDNO：4)；右腿：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’(SEQIDNO：5)。根据本专利技术，优选地，该试剂盒还包括：(3)重组酶聚合酶及RPA等温扩增试剂；和/或(4)RPA等温扩增引物，包括：5’-GCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAG-3’(SEQIDNO：6)，和5’-CCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTA-3’(SEQIDNO：7)。所述重组酶聚合酶及RPA等温扩增试剂包括所述重组酶聚合酶以及RPA等温扩增所需要的各种试剂，其可直接以重组酶聚合酶扩增试剂盒的形式提供。如图1所示，本专利技术的原理是利用TALENs特异性识别双链DNA的能力，通过设计特殊的“拟人”分子信标，其结构下面连接有可与TALENs特异结合的双链DNA，当体系中存在TALENs时，TALENs会与连接的双链DNA识别并结合，蛋白的空间位阻会把分子信标的发卡结构打开，荧光基团和猝灭基团距离变远，荧光就会恢复。当体系中存在目标物的DNA时，会和发卡结构上的双链DNA竞争性结合TALENs蛋白，因此荧光强度会随着目标物的增多而减弱，从而实现检测的目的。根据上述原理，荧光基团和与其相应的猝灭基团可以为各种荧光基团-猝灭基团对，优选地，所述荧光基团为FAM；所述猝灭基团为BHQ-1。本专利技术中，所述TALENs可以在实验室采用常规的表达载体构建和蛋白原核表达制备，该方法为本领域技术人员公知，也可直接从公司购买。所述“拟人”分子信标的DNA和荧光基团可商购获得，例如由上海生工生物有限公司合成。所述RPA等温扩增试剂盒可商购获得，例如从英国TwistDx公司购买。本专利技术的第二方面提供一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，该方法包括：(1)获取特异识别大肠杆菌O157:H7的16SrDNA的转录激活因子样效应物核酸酶；(2)获取“拟人”分子信标，所述分子信标由以下部分经变复性获得：发夹：5’-GATCAACTACTACTTGGTAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTTGTTTCTCTAATTAAGGC-3’；其中，5’端第18位T碱基上和3’端第18位T碱基上分别连接有荧光基团和与其相应的猝灭基团；左臂：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAATCCAAGTAGTAGTTGATC-3’；右臂：5’-GCCTTAATTAGAGAAACTTTACTCACCCGTCCGCCA-3’；左腿：5’-TTACTCACCCGTCCGCCA-3’；右腿：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’；(3)对大肠杆菌O157:H7的16SrDNA进行RPA等温扩增，获得目标序列；所述目标序列是18bp的双链DNA，为16SrDNA的一部分；目标序列中的一条链具有如下碱基序列：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’；(4)将目标序列、分子信标、转录激活因子样效应物核酸酶混合，震荡反应；测定震荡反应产物的荧光值；(5)按照上述方法检测一系列不同浓度的大肠杆菌O157:H7，建立大肠杆菌O157:H7浓度与荧光值的标准曲线；(6)按照上述方法检测未知浓度的含大肠杆菌O157:H7样品，测定荧光值，代入步骤(5)的标准曲线，计算出样品中大肠杆菌O157:H7的浓度。根据本专利技术的方法，优选地，分子信标合成过程包括：将发卡、左臂、右臂、左腿、右腿、双蒸水充分混合，然后高温变性，逐渐降到室温。具体地，所述高温变性的条件包括：在95℃保持2-5min。所述发卡、左臂、右臂、左腿、右腿的浓度优选均为5-20μM。检测时，可对TALENs和“拟人”分子信标的浓度进行优化，从而确定最优用量。所述TALENs的浓度优化方法如下：5μL目标物与准备好的5μL分子信标(50nM)和纯化浓缩后的50μLTALENs(浓度分别为0.01mg/mL、0.02本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组份：(1)转录激活因子样效应物核酸酶；能够特异识别大肠杆菌O157:H7的16S rDNA；(2)“拟人”分子信标，由以下部分组成：发夹：5’‑GATCAACTACTACTTGGTAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTTGTTTCTCTAATTAAGGC‑3’；其中，5’端第18位T碱基上和3’端第18位T碱基上分别连接有荧光基团和与其相应的猝灭基团；左臂：5’‑TGGCGGACGGGTGAGTAATCCAAGTAGTAGTTGATC‑3’；右臂：5’‑GCCTTAATTAGAGAAACTTTACTCACCCGTCCGCCA‑3’；左腿：5’‑TTACTCACCCGTCCGCCA‑3’；右腿：5’‑TGGCGGACGGGTGAGTAA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组份：(1)转录激活因子样效应物核酸酶；能够特异识别大肠杆菌O157:H7的16SrDNA；(2)“拟人”分子信标，由以下部分组成：发夹：5’-GATCAACTACTACTTGGTAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTTGTTTCTCTAATTAAGGC-3’；其中，5’端第18位T碱基上和3’端第18位T碱基上分别连接有荧光基团和与其相应的猝灭基团；左臂：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAATCCAAGTAGTAGTTGATC-3’；右臂：5’-GCCTTAATTAGAGAAACTTTACTCACCCGTCCGCCA-3’；左腿：5’-TTACTCACCCGTCCGCCA-3’；右腿：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’。2.根据权利要求1所述的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒，其中，该试剂盒还包括：(3)重组酶聚合酶及RPA等温扩增试剂；和/或(4)RPA等温扩增引物，包括：5’-GCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAG-3’，和5’-CCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTA-3’。3.根据权利要求1所述的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒，其中，所述荧光基团为FAM；所述猝灭基团为BHQ-1。4.一种基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，其特征在于，该方法包括：(1)获取特异识别大肠杆菌O157:H7的16SrDNA的转录激活因子样效应物核酸酶；(2)获取“拟人”分子信标，所述分子信标由以下部分经变复性获得：发夹：5’-GATCAACTACTACTTGGTAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTTGTTTCTCTAATTAAGGC-3’；其中，5’端第18位T碱基上和3’端第18位T碱基上分别连接有荧光基团和与其相应的猝灭基团；左臂：5’-TGGCGGACGGGTGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：白家磊，宁保安，彭媛，王江，李双，高志贤，王瑜，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12