一种用于基因检测的血小板核酸文库构建方法和试剂盒技术

技术编号:19712383 阅读:42 留言:0更新日期:2018-12-08 18:21
本发明专利技术公开了用于基因检测的血小板核酸文库构建方法和试剂盒。所述核酸捕获探针从5'开始,依次为,5'端生物素修饰、扩增引物序列P1、测序接头序列P5、样本标签序列、单分子标签序列和多聚胸腺嘧啶Oligo(dT)序列。还提供含有该核酸捕获探针的试剂盒,和使用该核酸捕获探针进行血小板核酸文库的构建方法。本发明专利技术大幅度降低了血小板的起始量,可从少量全血中分离血小板,直接进行微量扩增和文库构建,适用于液体活检的需求。此外,本发明专利技术可将不同受检者的样本混合至同一反应体系中,从而提高检测的通量,具有重要的临床意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于基因检测的血小板核酸文库构建方法和试剂盒
本专利技术涉及测序领域,尤其涉及用于基因检测的血小板核酸文库构建方法和试剂盒。
技术介绍
癌症的早期诊断意味着可以提早治疗,对患者的预后及生存极其关键,是提高癌症生存率的最佳方法。以肺癌为例,肺癌是中国乃至世界范围内发病率和病死率最高的肿瘤,确诊时分期较晚是影响肺癌预后的重要原因,而早期肺癌可以通过多学科综合治疗实现较好的预后,甚至达到治愈的目的。目前,肺癌主要采用低剂量螺旋CT筛查,胸部增强CT、上腹部增强CT(或B超)、头部增强MR(或增强CT)以及全身骨扫描进行诊断和分期的基本策略。如果CT扫描显示有可疑的恶性特性,那么医生将会进一步采取组织活检的方法,对肿瘤组织取样进行病理诊断。鉴于低剂量螺旋CT存在一定的电离辐射,筛查会增加较低的辐射致癌风险,指南建议高危人群每年接受一次低剂量螺旋CT筛查。而该方法还存在一定的假阳性,它会发现一些需要更多检查来确认的异常,而这些异常经证明并非癌症,这将同时增加受检者的生理和心理负担。因此,迫切需要一种风险更低的无创筛查和诊断方法。目前,癌症的无创筛查手段以肿瘤标志物为主,例如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA和CA199等,但其诊断的灵敏度和特异性较低,需同时选择多种肿瘤标志物联合测定,一般用于辅助诊断。近年来,随着越来越多临床证据的出现,利用分子诊断技术指导患者个体化的精准治疗已逐渐成为共识。其中,液体活检作为体外诊断的一个分支,主要检测物包括血液中游离的循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和外泌体,其优势在于以非侵入性的取样方式大大降低了组织活检的弊端。然而,目前的检测物含量低且分离成本高,限制了检测方法的快速发展。正常机体中血小板主要通过释放和聚集功能,发挥促凝血以及促进伤口愈合的作用。在重大疾病如急慢性炎症或肿瘤的微环境中,可导致血小板特定的pre-mRNAs发生剪接,进而影响血小板的基因表达谱。此外,血小板是血液中第二丰富的细胞类型,获取方便,分离操作简单,可用作新的检测物。因此,对经过驯化的血小板如肿瘤驯化血小板(TumorConditionedPlatelets)进行RNA检测,检测受检者是否罹患癌症,已成为一种新的液体活检方法。中国专利申请201610911677.X公开了一种用于肿瘤早期筛查的肿瘤血小板RNA定量检测模型及方法,所述模型包括PCR检测特异性引物,用以临床诊断肿瘤血小板RNA生物标志物组合,包括CD79A、CD81、SYTL1、CENPC、TTN、RHOH、ZNF101、TRABD2A和TRAC。所述方法包括制备样本、提取RNA、逆转录、PCR检测、用算式计算Y值和结果评判。该专利使用RNA联合标志物诊断肿瘤的灵敏度能达到92.5%,高于目前临床常用生物标志物灵敏度。但该专利采用PCR定量的方法,一次只检测9个RNA生物标志物,只能区分癌症患者与健康人,无法进一步区分肿瘤类型。中国专利申请201710731914.9公开了一种用于非小细胞肺癌诊断的血小板LncRNA的定量检测方法,证实NSCLC患者血小板长链非编码RNAMAGI2-AS3、ZFAS1的表达低于正常人,基于此制备出用于非小细胞肺癌诊断的实时荧光定量PCR的试剂盒。通过联合MAGI2-AS3和ZFAS1实时荧光定量PCR扩增获得的表达量数据,建立了非小细胞肺癌诊断的Logistic回归拟合数据模型,该模型对非小细胞肺癌有较高的诊断效能和敏感性。然而,该专利只检测血小板长链非编码RNAMAGI2-AS3和ZFAS1表达量,应用范围有限,只能用于非小细胞肺癌诊断,难以满足临床需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种血小板核酸文库的构建方法。为实现上述目的,本专利技术提供一种核酸捕获探针,其特征在于,所述核酸捕获探针从5'开始,依次为,5'端生物素修饰、扩增引物序列P1、测序接头序列P5、样本标签序列、单分子标签序列和多聚胸腺嘧啶Oligo(dT)序列;进一步,所述扩增引物序列P1如SEQIDNO:1所示,测序接头序列P5如SEQIDNO:2所示,样本标签序列由3~4个核苷酸组成,单分子标签序列由10个核苷酸组成,多聚胸腺嘧啶Oligo(dT)序列由20个T碱基组成。本专利技术还提供一种试剂盒,其特征在于,含有所述核酸捕获探针。本专利技术还提供一种血小板核酸文库的构建方法,其特征在于,方法为:采集全血;超纯血小板的分离;血小板RNA的微量扩增:使用权利要求1或2所述核酸捕获探针;或权利要求3所述试剂盒中的核酸捕获探针进行微量扩增,获得血小板全长cDNA的扩增产物;血小板核酸文库的构建。进一步,所述采集全血为使用含抗凝剂的真空采血管采集静脉血,采集后轻轻颠倒采血管数次,使抗凝剂与全血充分混匀。进一步,所述超纯血小板的分离为采用离心使所得超纯血小板中的白细胞污染率低于0.0001%;优选的,采用两步离心法;更优选的,在两步离心法中间采用双免疫磁珠去除白细胞和红细胞。进一步,所述血小板RNA的微量扩增为以超纯血小板的RNA为模板,权利要求1或2所述核酸捕获探针,或权利要求3所述试剂盒中的核酸捕获探针为引物,利用反转录酶反转录合成与血小板的RNA互补的一链cDNA,并利用反转录酶的模板置换活性在一链cDNA的3'端加上一段扩增引物序列P1如SEQIDNO.1所示;以合成得到的与血小板的RNA互补的一链cDNA为模板,如SEQIDNO.4所示的扩增引物序列P2为引物,多轮扩增并纯化,获得血小板全长cDNA的扩增产物;优选的,可将多个不同样本的一链cDNA混合,在同一反应体系中进行扩增,获得不同来源的血小板全长cDNA的扩增产物。进一步,所述血小板核酸文库的构建为使用转座酶和测序接头对所得的获得血小板全长cDNA的扩增产物进行片段化和加接头,使用测序引物对片段化产物进行PCR扩增,富集cDNA的5'端;利用AmPureXPBeads分选并纯化扩增产物,获得5'端携带分子标签的血小板核酸文库;优选的,其中,测序接头的序列如SEQIDNO:4所示,测序引物的序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。本专利技术还提供一种基因表达水平数据的获得方法,其特征在于,按照所述方法构建血小板核酸文库后,对血小板核酸文库的片段进行高通量测序,利用样本标签对测序数据进行拆分,区分同一来源的血小板核酸数据,并对每个样本的测序数据进行质控、参考基因组比对、计算基因表达水平量的生物信息学分析,获得样本的基因表达水平数据。本专利技术还提供一种分析血小板的基因表达水平的方法,其特征在于,对获得的样本的基因表达水平数据进行分析,步骤如下:学习样本库的建立:采用matlab的模块bioma.data.DataMatrix的生成n*m1的数据矩阵Cancer_healthy;待测样本库的建立:采用matlab的模块bioma.data.DataMatrix的生成n*m2的数据矩阵Test_sample;差异基因矩阵选取:调用matlab中的BioinformaticsToolbox工具箱,分析数据矩阵Cancer_healthy中两种样本之间的差异基因,将差异基因进行选取得到一个m1*k的矩阵,及k*1的矩阵cancer_healthy_k1;数据格式化处理本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种核酸捕获探针,其特征在于,所述核酸捕获探针从5'开始,依次为,5'端生物素修饰、扩增引物序列P1、测序接头序列P5、样本标签序列、单分子标签序列和多聚胸腺嘧啶Oligo(dT)序列。

【技术特征摘要】
1.一种核酸捕获探针,其特征在于,所述核酸捕获探针从5'开始,依次为,5'端生物素修饰、扩增引物序列P1、测序接头序列P5、样本标签序列、单分子标签序列和多聚胸腺嘧啶Oligo(dT)序列。2.如权利要求1所述核酸捕获探针,其特征在于,所述扩增引物序列P1如SEQIDNO:1所示,测序接头序列P5如SEQIDNO:2所示,样本标签序列由3~4个核苷酸组成,单分子标签序列由10个核苷酸组成,多聚胸腺嘧啶Oligo(dT)序列由20个T碱基组成。3.一种试剂盒,其特征在于,含有权利要求1或2所述核酸捕获探针。4.一种血小板核酸文库的构建方法,其特征在于,方法为:采集全血;超纯血小板的分离;血小板RNA的微量扩增:使用权利要求1或2所述核酸捕获探针;或权利要求3所述试剂盒中的核酸捕获探针进行微量扩增,获得血小板全长cDNA的扩增产物;血小板核酸文库的构建。5.如权利要求4所述血小板核酸文库的构建方法,其特征在于,所述采集全血为使用含抗凝剂的真空采血管采集静脉血,采集后轻轻颠倒采血管数次,使抗凝剂与全血充分混匀。6.如权利要求4所述血小板核酸文库的构建方法,其特征在于,所述超纯血小板的分离为采用离心使所得超纯血小板中的白细胞污染率低于0.0001%;优选的,采用两步离心法;更优选的,在两步离心法中间采用双免疫磁珠去除白细胞和红细胞。7.如权利要求4所述血小板核酸文库的构建方法,其特征在于,所述血小板RNA的微量扩增为以超纯血小板的RNA为模板,权利要求1或2所述核酸捕获探针,或权利要求3所述试剂盒中的核酸捕获探针为引物,利用反转录酶反转录合成与血小板的RNA互补的一链cDNA,并利用反转录酶的模板置换活性在一链cDNA的3'端加上一段扩增引物序列P1如SEQIDNO.1所示;以合成得到的与血小板的RNA互补的一链cDNA为模板,如SEQIDNO.4所示的扩增引物序列P2为引物,多轮扩增并纯化,获得血小板全长cDNA的扩增产物;优选的,可将多个不同样本的一链cDNA混合,在同一反应体系中进行扩增,获得不同来源的血小板全长cDNA的扩增产物。8.如权利要求4所述血小板核酸文库的构建方法,其特征在于,所述血小板核酸文库的构建为使用...

【专利技术属性】
技术研发人员:肖剑萍叶国栋许剑雄陈茂立韩大雄郭奇伟蔡逸民杨燕燕李顺杰董康梅朱莎莎张丽芳宋丹
申请(专利权)人:厦门生命互联科技有限公司
类型:发明
国别省市:福建,35

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