一种测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的方法技术

技术编号:19712373 阅读:37 留言:0更新日期:2018-12-08 18:21
本发明专利技术公开了一种测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的方法。包括共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞在SED和Raji细胞并存的条件下检测抗人LAG3抗体活性的方法。此发明专利技术方法能快速准确地检测结合人LAG3蛋白的分子的活性。

【技术实现步骤摘要】
一种测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的方法
本专利技术属于生物
,涉及一种测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的方法。
技术介绍
LAG3(LymphocyteActivationGene-3,淋巴细胞活化基因3)是一种免疫检查点蛋白,包含4个Ig样的区域,结构与CD4分子类似,能与MHC-Ⅱ(主要组织相容性复合体)分子结合。现已证实,LAG3能负向调节T细胞的活化和增殖,通常表达在肿瘤组织浸润的T细胞表面,是T细胞能力衰竭的标志。通过影响LAG3的功能可以改善人体在病毒感染或自身免疫疾病以及恶性肿瘤所带来的免疫系统的功能紊乱,改善疾病的预后。随着免疫检查点抗体药物在肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用,多种的LAG3相关药物处于临床和临床前研究中。由于LAG3负向调节T细胞的活性,所以能抑制T细胞表面的LAG3分子功能就可以增强T细胞的抗肿瘤能力。目前也有多家制药公司都在研发针对抗人LAG3的单克隆抗体。抗人LAG3抗体通过特异性结合LAG3分子来抑制LAG3的功能,达到增强T细胞的抗肿瘤效力,从而最大化动员患者自身的免疫系统反应杀伤肿瘤细胞达到治疗肿瘤的目的。所以探究一种快速而准确的检测这些抗体药物对激活T细胞作用的方法是十分必要的。荧光素酶报告基因是一种常用于哺乳动物细胞的报告基因,随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用,无需裂解细胞即可催化荧光底物发光而检测酶活性。由于具有没有放射性、比其他报告基因速度快、且半衰期较短不会在效应细胞中积累的优点,荧光素酶报告基因已经用于检测多种药物的活性。目前已有通过利用传统检测PBMC或T细胞因子释放的方法来反映抗LAG3抗体的生物活性,但只能进行相对比较,不能具体量化。传统因子检测方法易受PBMC或T细胞个体差异的影响,重复性不好,工作量较大且拖延的时间较长(至少需要3天以上)。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述缺陷,提供一种快速准确的测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的方法。本专利技术的另一目的是提供一种用于测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的Jurkat细胞。本专利技术的又一目的是提供一种用于测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的试剂盒。本专利技术的目的通过以下技术方案实现:本专利技术原理:本专利技术利用稳定转染表达了NFAT报告原件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞和表达MHC-Ⅱ的递呈细胞组成的检测系统来检测人LAG3蛋白结合分子的活性。本专利技术通过测定Jurkat-NFAT-LAG3细胞的荧光素酶催化化学底物发光的强度或Jurkat-NFAT-LAG3细胞分泌的IL2因子的量来判断结合人LAG3蛋白的分子活性高低。Jurkat-NFAT在超抗原(如肠毒素亚型DStaphylococcalEnterotoxinD,简称SED)和具有MHC-Ⅱ表达的递呈细胞(如Raji细胞)同时存在的条件下,递呈细胞表面的MHC-Ⅱ分子会通过结合Jurkat细胞表面的TCR受体,激活NFAT报告元件和IL2表达通路,产生正信号包括发光信号和细胞因子(如IL2)分泌。当Jurkat-NFAT上稳定转染表达LAG3分子后,LAG3分子会与具有递呈细胞的MHC-Ⅱ结合,抑制正信号包括发光信号和IL2因子分泌。在LAG3蛋白结合分子如LAG3抗体存在下,会抑制LAG3分子与MHC-Ⅱ的结合,正信号得到恢复。此专利技术方法能快速准确地检测LAG3蛋白结合分子的生物学活性。本专利技术所述的LAG3蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。一种测定LAG3蛋白结合分子的生物学活性的方法,其特征在于包括在共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞、超抗原和表达MHC-Ⅱ的递呈细胞并存的条件下,加入LAG3蛋白结合分子,LAG3蛋白结合分子与Jurkat细胞表达的LAG3蛋白特异性结合,使TCR通路保持激活状态,从而使NFAT报告元件表达荧光素酶,催化化学底物发光以及Jurkat细胞分泌细胞因子;通过测定发光强度或分泌细胞因子的量实现对LAG3蛋白结合分子生物活性的定量检测。所述的LAG3蛋白结合分子为LAG3的特异性抗体或其他能够与LAG3蛋白特异性结合的生物大分子。所述的LAG3抗体选自relatlimab(百时美施贵宝)、LAG525(诺华)、REGN3767(再生元)、MK-4280(Merk公司)、MGD013(MacroGenics)、Sym022(Fstar)、FS118(Symphogen)、GSK2831781(葛兰素史克)中的任意一种。所述的具有MHC-Ⅱ表达的递呈细胞优选Raji细胞或Daudi细胞(人Burkitt's淋巴瘤细胞)。更优的是用Raji细胞,Raji细胞高表达MHC-Ⅱ分子。所述的Jurkat-NFAT-LAG3的细胞数优选1×105个/well(96孔板);所述的Raji细胞数为共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞数的1/10-1/2。所述的Raji细胞数优选共表达NFAT和人LAG3蛋白的Jurkat细胞数的1/2、1/4、1/6、1/8或1/10。所述的共表达NFAT和人LAG3蛋白的Jurkat细胞通过如下方法构建:将包含NFAT报告元件的质粒和包含人LAG3全长的质粒通过电转染的方式转染到Jurkat细胞中,并通过加入潮霉素和嘌呤霉素加压筛选稳定表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞。所述的超抗原选自SEA、SEB、SED、SEE中的任意一种,优选SED(即肠毒素亚型D)。所述的超抗原的浓度优选25-200ng/mL。所述的细胞因子选自干扰素γ、IL2、IL8、肿瘤坏死因子α中的任意一种,优选IL2。一种用于测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的Jurkat细胞Jurkat-NFAT-LAG3,该细胞为共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞,通过以下方法构建:将包含NFAT报告元件的质粒和包含人LAG3全长序列的质粒通过电转染的方式转染到Jurkat细胞中,并通过加入潮霉素和嘌呤霉素加压筛选稳定表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞。所述的共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞为人T淋巴细胞白血病细胞JNL-35B8,2018年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏编号为CCTCCNO:2018130。本专利技术所述的Jurkat细胞在测定LAG3蛋白结合分子生物学活性中的应用。本专利技术所述的Jurkat细胞在制备LAG3蛋白结合分子生物学活性的试剂盒中的应用。用于测定LAG3蛋白结合分子生物学活性的试剂盒,包括共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞、超抗原、Raji细胞、具有浓度梯度的LAG3蛋白结合分子的稀释液以及荧光素酶底物。所述的LAG3蛋白结合分子优选LAG3的特异性抗体或其他能够与LAG3蛋白特异性结合的生物大分子;所述的超抗原优选SED,SED的浓度优选25-200ng/ml;所述的具有MHC-Ⅱ表达的递呈细胞优选Raji细胞或Daudi细胞,进一步优选Raji细胞。所述的试剂盒还可以优选包含细胞因子检测试剂;所述的细胞因子检测试剂优选检测干扰素γ、IL2、IL8、肿瘤坏死因本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种测定LAG3蛋白结合分子的生物学活性的方法,其特征在于包括在共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞、超抗原和表达MHC‑Ⅱ的递呈细胞并存的条件下,加入LAG3蛋白结合分子,LAG3蛋白结合分子与Jurkat细胞表达的LAG3蛋白特异性结合,使TCR通路保持激活状态,从而使NFAT报告元件表达荧光素酶,催化化学底物发光以及Jurkat细胞分泌细胞因子;通过测定发光强度或分泌细胞因子的量实现对LAG3蛋白结合分子生物活性的定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种测定LAG3蛋白结合分子的生物学活性的方法,其特征在于包括在共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞、超抗原和表达MHC-Ⅱ的递呈细胞并存的条件下,加入LAG3蛋白结合分子,LAG3蛋白结合分子与Jurkat细胞表达的LAG3蛋白特异性结合,使TCR通路保持激活状态,从而使NFAT报告元件表达荧光素酶,催化化学底物发光以及Jurkat细胞分泌细胞因子;通过测定发光强度或分泌细胞因子的量实现对LAG3蛋白结合分子生物活性的定量检测。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的LAG3蛋白结合分子为LAG3的特异性抗体或其他能够与LAG3蛋白特异性结合的生物大分子;所述的LAG3的特异性抗体选自relatlimab、LAG525、REGN3767、MK-4280、MGD013、Sym022、FS118、GSK2831781中的任意一种。3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的具有MHC-Ⅱ表达的递呈细胞为Raji细胞或Daudi细胞,优选Raji细胞。4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于Raji细胞数为共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞数的1/10~1/2。5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于Raji细胞数为共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞数的1/2、1/4、1/6、1/8或1/10。6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的共表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞通过如下方法构建:将包含NFAT报告元件的质粒和包含人LAG3全长的质粒通过电转染的方式转染到Jurkat细胞中,并通过加入潮霉素和嘌呤霉素加压筛选稳定表达NFAT报告元件和人LAG3蛋白的Jurkat细胞。7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的超抗原选自SEA、SEB、SED、SEE中的任意一种,优选SED。8.根据权利要求7述的方法,其特征在于所述的SED的浓度为25-200ng/...

【专利技术属性】
技术研发人员:康小强赖寿鹏张鹏黄潇管静
申请(专利权)人:南京维立志博生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:江苏,32

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