【技术实现步骤摘要】
一种生产重血小板源生长因子的方法
本专利技术涉及一种生产重血小板源生长因子的方法,属于生物
技术介绍
重组血小板源生长因子(Plateletderivedgrowthfactor,PDGF)是贮存于血小板α颗粒中的一种碱性蛋白质,是低分子量促细胞分裂素。能刺激停滞于G0/G1期的成纤维细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞等多种细胞进入分裂增殖周期。血小板源生长因子PDGF于1974年发现的一种刺激结缔组织等组织细胞增长肽类调节因子,因其来源于血小板而得名,正常生理状态下存在于血小板的α颗粒内,当血液凝固时由崩解的血小板释放出来并且被激活,具有刺激特定细胞趋化与促进特定细胞生长的生物活性。此外,在组织受到损伤时巨噬细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、胚胎干细胞等也可以合成并释放PDGF。肝脏受损时,巨噬细胞、血小板、浸润的炎细胞、受损的内皮细胞及激活的肝星形细胞均可以分泌PDGF,以自分泌、旁分泌的方式发挥作用。结合的PDGF是分子量为30KD的热稳定糖蛋白,是靠二硫键相连的A、B两条多肽链组合成的二聚体。常见的血小板源生因子PDGF是由两条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体,其分子量为28-31KDa,可形成PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-AB三种异构体。在人类血小板来源中约85%-90%为AB型(分子量为22.5KDa,其中A链为13.3KDa,B链为12.2KDa),约10%-15%为BB型。老年人的血小板也可含有多量的PDGF-BB,高达30%,而新鲜的血小板也可含有高达27%的PDGF-AA。PDGF亚型的浓度是直接与 ...
【技术保护点】
1.一种表达生产重组血小板源生长因子的方法,其特征在于,将来源于人的rhPDGF‑BB基因置于表达载体pCHO1.0中,转化CHO细胞株,获得分泌表达rhPDGF‑BB的工程细胞株,培养该工程细胞株使之生产重组血小板源生长因子,包括以下步骤:1)一级种子培养,2)二级种子培养,3)反应器连续流加培养,用基础培养基将二级种子细胞按1.0×106个/ml的接种密度稀释至2L细胞培养反应器中,得到1L的二级种子细胞与基础培养基混合物;搅拌转速设置为280r/min;pH设置为6.95±0.15,pH值通过碳酸氢钠溶液和CO2进行调节;溶解氧设置为40±20%,氧气气体流量为1.5~400ml/min,根据溶氧消耗情况调整氧气气体流量;1~4天培养温度设置为36.5±0.5℃,第5天降温至33.5±0.5℃,发酵14天结束;连续流加培养过程中,第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料,补料体积为40mL;当葡萄糖浓度低于2.0g/L时,补加葡萄糖浓缩液使葡萄糖浓度增至4.0g/L。
【技术特征摘要】
1.一种表达生产重组血小板源生长因子的方法,其特征在于,将来源于人的rhPDGF-BB基因置于表达载体pCHO1.0中,转化CHO细胞株,获得分泌表达rhPDGF-BB的工程细胞株,培养该工程细胞株使之生产重组血小板源生长因子,包括以下步骤:1)一级种子培养,2)二级种子培养,3)反应器连续流加培养,用基础培养基将二级种子细胞按1.0×106个/ml的接种密度稀释至2L细胞培养反应器中,得到1L的二级种子细胞与基础培养基混合物;搅拌转速设置为280r/min;pH设置为6.95±0.15,pH值通过碳酸氢钠溶液和CO2进行调节;溶解氧设置为40±20%,氧气气体流量为1.5~400ml/min,根据溶氧消耗情况调整氧气气体流量;1~4天培养温度设置为36.5±0.5℃,第5天降温至33.5±0.5℃,发酵14天结束;连续流加培养过程中,第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料,补料体积为40mL;当葡萄糖浓度低于2.0g/L时,补加葡萄糖浓缩液使葡萄糖浓度增至4.0g/L。2.根据权利要求1所述的一种表达生产重组血小板源生长因子的方法,其特征在于,步骤1)一级种子培养,是用预热至36.5±0.5℃的种子培养基将细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增培养,摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃,6±1%CO2,130r/min;每次扩增培养3±1天,扩增3次,扩增过程中活细胞密度不超过6.0×106个/ml。3.根据权利要求1或2所述的一种表达生产重组血小板源生长因子的方法,其特征在于,步骤2)二级种子的制备,是用预热至36.5±0.5℃的基础培养基将一级种子细胞按0.5±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增,摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃,6±1%CO2,130r/min;每次扩增培养3±1天,扩增2次,扩增过程中活细胞密度不超过6.0×10...
【专利技术属性】
技术研发人员:黄高敏,查鑫华,徐小芳,
申请(专利权)人:苏州锐妥欣生物技术有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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