固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，包括以下步骤：（1）植物乳杆菌活化、（2）细胞琼脂固定化、（3）固定细胞发酵、（4）固液分离、（5）除蛋白、（6）沉淀多糖、（7）冷冻干燥。本发明专利技术使用固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖，细胞均匀分散在凝胶珠中，可以持久保持菌种活力和胞内酶活状态；还可保护菌体不受酸、碱、有害离子等不利条件的影响，进行持续性生产；并且固定化颗粒还有利于简化菌种活化、产物提取工艺。因此可以被反复多次使用，能有效地提高菌株使用率，降低生产成本，使高产量、连续化工业生产乳酸菌胞外多糖成为可能。

【技术实现步骤摘要】
固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺
本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺。
技术介绍
微生物产胞外多糖(ExopoLySaccharides，EPS)有一些对人体具有特殊效用，如促进免疫反应和抗溃疡活性，这些特性是其在功能性食品领域迅猛发展的强力保障，已被广泛应用于食品添加剂工业。近年来，微生物多糖类物质越来越受到重视。其中，对香菇多糖和细菌多糖研究最多，应用范围最广。早在19世纪下半叶，科学家们已经确认了微生物可以合成EPS。当时就已经证实79属168种微生物都可以合成胞外多糖，与其对应还存在细胞内的多糖等。乳酸菌胞外多糖分子量大约为4.0×104~6.0×106之间。尽管长期以来研究者们对乳酸菌产EPS的化学组成存在着分歧，但是较一致认为从乳酸菌中分离得到的胞外聚合物是由α-和β-连接糖重复单元所组成的多糖，并且不同乳酸菌分泌的EPS类型不同。虽然单糖组成可能有些相似，多为半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，但是各成分比率不同。由于乳酸菌是食品级工业生产细菌，具有比其他细菌更高的安全性，故此近年来乳酸菌EPS的研究逐渐增多。但产量过低，稳定性差仍是制约乳酸菌EPS大规模发酵生产的主要影响因素。在实际加工生产过程中，乳酸菌EPS生产成本过高也制约其大规模的工业化生产。因此，目前乳酸菌EPS仍主要用于提高奶制品和蛋糕奶酪等食品的质量。但是值得注意的是，EPS也具有免疫学活性，抗癌细胞，抗肠道溃疡等生物学活性，在医学制药领域有巨大价值。来自全球范围科学工作者正尝试通过途径工程（第三代基因工程）来构建产量较高的菌体细胞系，但还尚未成功。细胞固定化技术是将微生物菌体活细胞固定在特定的载体上，使其菌体细胞高密度密集并保持其生物学活性，在适宜的条件下还可进行菌体增殖，以满足发酵生产工艺的要求。30多年前乳酸菌固定化细胞发酵就开始引起人们的关注。将乳酸菌进行固定化有较多优点，目前主要用于生产乳酸、乳制品以及Nisin等。微生物细胞的固定化方法以包埋法和吸附法最为常用。研究表明，固定化乳酸菌在保护细胞、连续化生产中的作用是突出有效的。随着研究的不断深入，固定化乳酸菌发酵生产的范围也越来越广泛。由于乳酸菌是食品级工业生产细菌，具有比其他细菌更高的安全性，故此近年来乳酸菌胞外多糖(ExopoLySaccharides，EPS)的研究逐渐增多。但乳酸菌难于活化、稳定性差、EPS产量过低、EPS成分和结构复杂纯化困难等因素仍是制约乳酸菌EPS大规模发酵生产的主要因素。在实际加工生产过程中，乳酸菌EPS生产工艺复杂致使生产成本过高也制约其大规模的工业化生产。因此，目前乳酸菌EPS生产仅处于研究阶段，主要用于提高奶制品和蛋糕奶酪等食品的质量，一直没有办法工业化生产纯化产品。利用固定化技术发酵生产乳酸菌胞外多糖是解决目前面临问题的有效方法之一。细胞固定化技术是将微生物菌体活细胞固定在特定的载体上，使其菌体细胞高密度密集并保持其生物学活性，在适宜的条件下还可进行菌体增殖，以满足发酵生产工艺的要求。将乳酸菌进行固定化有较多优点，已有用于生产乳酸、乳制品以及Nisin等。但目前对于固定化乳酸菌发酵生产胞外多糖工艺还没有相关研究。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，包括以下步骤：（1）植物乳杆菌活化：将甘油保藏的植物乳杆菌菌种从冰箱内取出，待彻底解冻后，在无菌超净工作台用移液枪吸取250μL接种于5mL灭菌后的MRS培养基中，在培养箱中于37℃下培养24h，然后以5%的接种量进行传代，活化两次，活力得到恢复后，以5%的接种量进行摇瓶发酵扩大培养，与此同时，将菌液1mL与灭菌后的甘油溶液（1mL）按体积比1:1混合后放至于-20℃冰箱中冷藏保存，备用；（2）细胞琼脂固定化：准确称取3.0克琼脂溶于100毫升蒸馏水中，在高压灭菌器中灭菌，灭菌后冷却至50℃待用，将经24h培养的乳酸菌发酵液进行离心（5000r/min，10min），除去上清，用无菌水将植物乳杆菌细胞转移至灭菌的培养皿中，然后倒入灭菌后的琼脂溶液并充分进行混合，冷却固化后，用刀将其切成小方块得到固定化植物乳杆菌颗粒，用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存备用；（3）固定细胞发酵：将固定化植物乳杆菌颗粒以3%的接种量接种于液体MRS液体培养基中摇瓶培养，于37℃下培养24h；（4）固液分离：发酵终止后用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存可重复使用；同时过滤后发酵液中加入三氯乙酸溶液，震荡摇匀，于4℃下放置12h静置沉淀；（5）除蛋白：在4℃，18000×g的离心力下离心30min，离心沉淀除蛋白取上清液；（6）沉淀多糖：向步骤（5）所得上清液中加入无水乙醇，处理12h，沉淀多糖；（7）冷冻干燥：在12000×g的离心力下离心30min，取沉淀，-80℃的冰箱冷冻2h；然后置于冷冻干燥机冷冻干燥1.5h；（8）透析：将离心冷冻干燥处理后的沉淀物用温水溶解稀释20倍，装入透析袋（MD34，截留分子质量8000-14000）透析，再次检漏，确认无误后，在4℃冰箱进行透析，直至离子强度不变为止（12h左右）。得纯多糖溶液，以苯酚-浓硫酸法测OD值。所述步骤（1）MRS液体培养基的组成为：葡萄糖20.0g，牛肉膏10.0g，吐温801.0g，蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，酵母浸粉5.0g，一水硫酸锰0.25g，柠檬酸氢二铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.58g，1.0L蒸馏水。所述步骤（1）中甘油溶液的体积分数为50%。所述步骤（2）中琼脂的浓度为30g/L，琼脂的粒径为1cm。所述步骤（2）中固定化植物乳杆菌颗粒为切割直径为1.0cm的固定化颗粒。所述步骤（4）中三氯乙酸与水，按体积比为1:1混合均匀配成体积分数为50%的三氯乙酸溶液，三氯乙酸溶液与发酵液的体积比为1:5。所述步骤（6）中加入无水乙醇的体积为上清液体积的3倍。本专利技术的有益效果：本专利技术使用固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖，细胞均匀分散在凝胶珠中，可以持久保持菌种活力和胞内酶活状态；还可保护菌体不受酸、碱、有害离子等不利条件的影响，进行持续性生产；并且固定化颗粒还有利于简化菌种活化、产物提取工艺。因此可以被反复多次使用，能有效地提高菌株使用率，降低生产成本，使高产量、连续化工业生产乳酸菌胞外多糖成为可能。乳酸菌产EPS能发挥保护菌体细胞免受侵蚀的作用。主要包括：保护乳酸菌细胞不受到某些有毒化合物的伤害；抵抗某些不利于菌体生长发育的环境；增强菌体抗性；鏊合金属离子和帮助细胞进行细胞间的识别。乳酸菌所产生的EPS还可以结合水分子，使菌体细胞耐受湿度较低的干燥环境。菌体细胞壁上的荚膜多糖可以保护菌体细胞免受噬菌体的裂解侵害。固定化方法大大简化了工艺流程。不需要多次活化菌种，避免了发酵液中分离细胞这一步骤，从而简化后续产物提取，而且固定化后的乳酸菌细胞，生物活性能够被较好地保持，可以被反复多次使用，能有效地提高了菌株使用率，降低生产成本。本专利技术找到了最佳固定化植物乳杆菌发酵生产EPS的工艺：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，其特征在于包括以下步骤：（1）植物乳杆菌活化：将甘油保藏的植物乳杆菌菌种从冰箱内取出，待彻底解冻后，在无菌超净工作台用移液枪吸取250μL接种于5mL灭菌后的MRS培养基中，在培养箱中于37℃下培养24h，然后以5%的接种量进行传代，活化两次，活力得到恢复后，以5%的接种量进行摇瓶发酵扩大培养，与此同时，将菌液1mL与灭菌后的甘油溶液按照体积比1:1混合后放至于‑20℃冰箱中冷藏保存，备用；（2）细胞琼脂固定化：准确称取3.0克琼脂溶于100毫升蒸馏水中，在高压灭菌器中灭菌，灭菌后冷却至50℃待用，将经24h培养的乳酸菌发酵液进行离心，除去上清，用无菌水将植物乳杆菌细胞转移至灭菌的培养皿中，然后倒入灭菌后的琼脂溶液并充分进行混合，冷却固化后，用刀将其切成小方块得到固定化植物乳杆菌颗粒，用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存备用；（3）固定细胞发酵：将固定化植物乳杆菌颗粒以3%的接种量接种于液体MRS液体培养基中摇瓶培养，于37℃下培养24h；（4）固液分离：发酵终止后用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存可重复使用；同时过滤后发酵液中加入三氯乙酸溶液，震荡摇匀，于4℃下放置12h静置沉淀；（5）除蛋白：在4℃、18000×g的离心力下离心30min，离心沉淀除蛋白取上清液；（6）沉淀多糖：向步骤（5）所得上清液中加入无水乙醇，处理12h，沉淀多糖；（7）冷冻干燥：在12000×g的离心力下离心30min，取沉淀，‑80℃的冰箱冷冻2h，然后置于冷冻干燥机冷冻干燥1.5h。...

【技术特征摘要】
1.一种固定化植物乳杆菌发酵生产胞外多糖的工艺，其特征在于包括以下步骤：（1）植物乳杆菌活化：将甘油保藏的植物乳杆菌菌种从冰箱内取出，待彻底解冻后，在无菌超净工作台用移液枪吸取250μL接种于5mL灭菌后的MRS培养基中，在培养箱中于37℃下培养24h，然后以5%的接种量进行传代，活化两次，活力得到恢复后，以5%的接种量进行摇瓶发酵扩大培养，与此同时，将菌液1mL与灭菌后的甘油溶液按照体积比1:1混合后放至于-20℃冰箱中冷藏保存，备用；（2）细胞琼脂固定化：准确称取3.0克琼脂溶于100毫升蒸馏水中，在高压灭菌器中灭菌，灭菌后冷却至50℃待用，将经24h培养的乳酸菌发酵液进行离心，除去上清，用无菌水将植物乳杆菌细胞转移至灭菌的培养皿中，然后倒入灭菌后的琼脂溶液并充分进行混合，冷却固化后，用刀将其切成小方块得到固定化植物乳杆菌颗粒，用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存备用；（3）固定细胞发酵：将固定化植物乳杆菌颗粒以3%的接种量接种于液体MRS液体培养基中摇瓶培养，于37℃下培养24h；（4）固液分离：发酵终止后用无菌纱布滤出颗粒，无菌水冲洗三次，4℃冰箱中干燥保存可重复使用；同时过滤后发酵液中加入三氯乙酸溶液，震荡摇匀，于4℃下放置12h静置沉淀；（5）除蛋白：在4℃、18000×g的离心力下离心30min，离心沉淀除蛋白取上清液；（6）沉淀多糖：向步骤（5）所得上清液中加入无...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶静，李红，凌飞跃，张志平，韩丽，张博，宋佳静，周安琪，
申请(专利权)人：郑州轻工业学院，
类型：发明
国别省市：河南,41