一种高密度发酵提高PQQ产率的方法技术

本发明专利技术涉及一种高密度发酵提高PQQ产率的方法，采用高细胞密度发酵技术应用于PQQ工业化大生产，通过种子罐培养和发酵罐培养，得到高含量的PQQ的发酵液。其有益效果为：本发明专利技术的高密度发酵提高PQQ产率的方法，大幅提高了PQQ代谢物含量和缩短发酵周期，降低了生产成本和提高了生产综合效率和效益，提高了PQQ产率；通过优化了培养料的配比，调整了补料配方，调高了罐压、转速，通风量，加大了反应速率，确保溶氧值，缩短了发酵周期等方法，使得得到的发酵菌株细胞密度显著提高为25‑35g/L，平均发酵周期为5‑6天，平均PQQ的发酵水平为2.0‑2.5g/L。

【技术实现步骤摘要】
一种高密度发酵提高PQQ产率的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高密度发酵提高PQQ产率的方法。
技术介绍
PQQ的学名叫吡咯喹啉醌，是一种新辅基，具有治疗心脏病，神经性疾病，保护肝脏，维护线粒体功能等作用。在原核生物、植物和哺乳动物中，都广泛存在着吡咯喹啉醌，它不仅是许多酶的辅基，在酶促反应中担负着传递电子、质子和化学基团的功能，也能刺激微生物的生长，植物花粉的萌发，促进植物的生长。PQQ的生物学功能主要有：刺激微生物、植物、动物以及人体细胞快速生长；清除体内多余的自由基；刺激神经生长因子生成；对哺乳动物心肌细胞具有保护作用等。其功效：机体重要的生长因子；调节机体自由基水平，保护机体；抗氧化损伤；增强线粒体功能；解毒；防止皮肤衰老，对黑色素沉着紊乱有着弱化作用；防治帕金森病；防治老年痴呆症等。PQQ的产业化、规模化尚需要一定的时间，但其在食品、轻工、农业和医药等方面都有着广阔的应用前景。随着PQQ被列为一种新型维生素，其功能相关的研究成为各大相关院校的研究热点，其在医药、食品和农业方面的巨大应用前景引起社会各界人士的追捧。未来市场保守估计在1000亿元上。目前，PQQ在国内主要作为试验试剂用于各大科研院所，工业PQQ产品的获得主要是通过化学合成法和微生物常规发酵法制得，存在有生产成本高，产率低，综合生产效率低下等问题，导致目前PQQ的售价高昂，虽然市场前景广阔，仍未能被广泛推广和应用。高细胞密度发酵(highcelldensityfermentation，HCDF)是最近一二十年发展起来的，通过应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量与目标产物比、获得高代谢产物的新型发酵技术。高细胞密度发酵目前报道应用的领域有：一是利用工程菌生产各种干扰素、生长因子、生物酶、肽类、多糖等活性成分；二是在食品工业中的应用高细胞密度发酵技术用于活细胞的培养；三是用于酵母菌生产酒精和利用螺旋藻细胞生产螺旋藻等。由于受限于发酵技术和设备，目前还尚未有在PQQ工业大生产方面的报道。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种高密度发酵提高PQQ产率的方法，其缩短了发酵周期，提高了PQQ产率。本专利技术的目的是提供一种高密度发酵提高PQQ产率的方法。根据本专利技术的具体实施方式的高密度发酵提高PQQ产率的方法，所述高密度发酵提高PQQ产率的方法包括以下步骤：(1)菌种活化：将生丝微菌菌种接入斜面培养基，培养后得到成熟斜面菌种；(2)种母液的制备：取步骤(1)制备的成熟斜面菌种接种于种子培养基中，摇床培养，得到种母液；(3)种子罐培养：采用1.5-2m3种子罐，加入纯净水至种子罐体积的50-60％，计算所需种子罐培养料边搅拌边加入除无水甲醇外的所有种子罐培养料，待原料完全溶解和分散均匀后用纯净水定容到种子罐体积的60-65％，混合均匀，调节pH至7.0，种子罐灭菌后冷却至25-35℃，加入经无菌过滤的无水甲醇，混合均匀，把步骤(2)中得到的种母液接入种子罐内，控制罐压0.08-0.10MPa，罐温30-35℃，空气流量0.8-1.0VVM，pH为6.8-7.0，通风搅拌培养42-50小时，形成种子罐培养菌液；每1.5m3的种子罐加入的所述种子罐培养料包括以下重量的原料：(4)发酵罐初始配制：采用20m3以上发酵罐，加入纯净水至发酵罐体积的30-40％，边搅拌边加入发酵罐培养料，待原料完全溶解和分散均匀后用纯净水定容到发酵罐体积的40-50％，混合均匀，调节pH至7.0，发酵罐灭菌后冷却至25-35℃，按10-20％接种比例，用无菌空气把步骤(3)得到的种子罐培养菌液从种子罐压入发酵罐，控制发酵罐初始压力0.08-0.10MPa，初始流量0.8-1VVM，初始搅拌速度110-130rpm/min，初始温度30℃；从种子罐内带入发酵罐内未利用完的无水甲醇作为发酵罐内甲醇的初始浓度；每20m3发酵罐加入的所述发酵罐培养料包括以下重量的原料：(5)发酵培养并补料：发酵前，在补料罐中加入纯净水和甘油，灭菌后加入经无菌过滤的无水甲醇，混合均匀形成补料；发酵过程中，当发酵罐内甲醇的浓度降到1000-1500ppm时，开始补料，使发酵罐内甲醇和甘油总的浓度始终保持为1000-1500ppm，边补料边发酵培养5-6天，得到PPQ的高含量发酵液。PPG2000为生物发酵行业常用的聚醚类消泡剂，具有良好的高温稳定性和消泡能力，对生物菌丝无毒性。矿物水，是指在纯净水的基础上添加了矿物质类食品添加剂而制成的。本专利技术中的矿物水的原料为：制备方法为，按上述顺序，在搅拌情况下，向装有纯净水的配料烧杯中依次加入上午原料至完全溶解，全部溶解并混合均匀后，用0.22μm的无菌滤膜进行过滤后备用。种子罐移种条件：镜检无杂菌，菌体饱满，染色深，OD值≥4.0。根据本专利技术的具体实施方式的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其中，步骤(3)中和步骤(4)中，均采用无菌过滤后的25％氨水调节pH。根据本专利技术的具体实施方式的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其中，步骤(3)中，所述种子罐灭菌具体为在总蒸汽压力大于0.3MPa情况下进汽实罐灭菌，控制温度121-125℃，压力0.10-0.12MPa，时间35-50min，冷却后体积为种子罐体积的60-80％。根据本专利技术的具体实施方式的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其中，步骤(4)中，所述发酵罐灭菌具体为采用总蒸汽压力大于0.4MPa情况下进汽实罐灭菌，控制温度121-125℃，压力0.10-0.12MPa，时间30-45min。根据本专利技术的具体实施方式的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其中，步骤(5)中，发酵过程中，培养温度为32-34℃，调节pH为6.5-7.0，控制罐压为0.08-0.20MPa，搅拌转速为110-200rpm/min，控制溶氧不低于30％。根据本专利技术的具体实施方式的高密度发酵提高PQQ产率的方法，进一步的，调节pH具体为：对数生长期间(第1到2天)调节pH为6.8，产抗期(第3-6天)调节pH为7.0。根据本专利技术的具体实施方式的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其中，步骤(5)中，补料罐中无水甲醇和甘油的体积比为18-20:5-3。补料罐中甲醇和甘油的总浓度始终为40-60％。根据本专利技术的具体实施方式的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其中，步骤(5)中，发酵过程中，补料速率为每小时30-50升，具体应根据控制发酵罐内甲醇和甘油的浓度保持在1000-1500PPM的标准向发酵罐内补料。根据本专利技术的具体实施方式的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其中，步骤(5)中，发酵过程中，加入消泡剂，对液面泡沫进行控制，防止逃液。所述消泡剂为PPG2000，PPG2000的浓度为20％，每20m3发酵罐加入1.5-5.0kg。根据本专利技术的具体实施方式的高密度发酵提高PQQ产率的方法，其中，步骤(5)中，发酵过程中，控制溶氧值具体为：通过调节罐压、通风量、通入空气中的氧气含量和搅拌转速，来确保发酵全程内溶氧值不低于30％。一般溶氧值为30-40％，发酵全程内氧气含量为25-35％。调整发酵罐的通风量为1:1.0-2.0，在空气中加入纯氧灭菌后通入到发酵罐中，使通入空气中的氧气含量达到25-35％；转速为11本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，所述高密度发酵提高PQQ产率的方法包括以下步骤：(1)菌种活化：将生丝微菌菌种接入斜面培养基，培养后得到成熟斜面菌种；(2)种母液的制备：取步骤(1)制备的成熟斜面菌种接种于种子培养基中，摇床培养，得到种母液；(3)种子罐培养：采用1.5‑2m3种子罐，加入纯净水至种子罐体积的50‑60％，计算所需种子罐培养料边搅拌边加入除无水甲醇外的所有种子罐培养料，待原料完全溶解和分散均匀后用纯净水定容到种子罐体积的60‑65％，混合均匀，调节pH至7.0，种子罐灭菌后冷却至25‑35℃，加入经无菌过滤的无水甲醇，混合均匀，把步骤(2)中得到的种母液接入种子罐内，控制罐压0.08‑0.10MPa，罐温30‑35℃，空气流量0.8‑1.0VVM，pH为6.8‑7.0，通风搅拌培养42‑50小时，形成种子罐培养菌液；每1.5m3的种子罐加入的所述种子罐培养料包括以下重量的原料：

【技术特征摘要】
1.一种高密度发酵提高PQQ产率的方法，其特征在于，所述高密度发酵提高PQQ产率的方法包括以下步骤：(1)菌种活化：将生丝微菌菌种接入斜面培养基，培养后得到成熟斜面菌种；(2)种母液的制备：取步骤(1)制备的成熟斜面菌种接种于种子培养基中，摇床培养，得到种母液；(3)种子罐培养：采用1.5-2m3种子罐，加入纯净水至种子罐体积的50-60％，计算所需种子罐培养料边搅拌边加入除无水甲醇外的所有种子罐培养料，待原料完全溶解和分散均匀后用纯净水定容到种子罐体积的60-65％，混合均匀，调节pH至7.0，种子罐灭菌后冷却至25-35℃，加入经无菌过滤的无水甲醇，混合均匀，把步骤(2)中得到的种母液接入种子罐内，控制罐压0.08-0.10MPa，罐温30-35℃，空气流量0.8-1.0VVM，pH为6.8-7.0，通风搅拌培养42-50小时，形成种子罐培养菌液；每1.5m3的种子罐加入的所述种子罐培养料包括以下重量的原料：(4)发酵罐初始配制：采用20m3以上发酵罐，加入纯净水至发酵罐体积的30-40％，边搅拌边加入发酵罐培养料，待原料完全溶解和分散均匀后用纯净水定容到发酵罐体积的40-50％，混合均匀，调节pH至7.0，发酵罐灭菌后冷却至25-35℃，按10-20％接种比例，用无菌空气把步骤(3)得到的种子罐培养菌液从种子罐压入发酵罐，控制发酵罐初始压力0.08-0.10MPa，初始流量0.8-1VVM，初始搅拌速度110-130rpm/min，初始温度30℃；每20m3发酵罐加入的所述发酵罐培养料包括以下重量的原料：(5)发酵培养并补料：发酵前，在补料罐中加入纯净水和甘油，灭菌后加入经无菌过滤的无水甲醇，混合均匀形成补料；发酵过程中，当发酵罐内甲醇的浓度降到1000-1500ppm时，开始补料，使发酵罐内甲醇和甘油总的浓度始终保持为1000-1500ppm，边补料边发酵培养5-6...

【专利技术属性】
技术研发人员：楼慧强，荣东，钞亚鹏，石家骥，褚伟立，周晓东，
申请(专利权)人：安徽新熙盟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34